细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]大鼠乳鼠心肌细胞培养

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 55  1/6 123456››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]大鼠乳鼠心肌细胞培养

雪山飞鹿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79771
精华 0
积分 153
帖子 85
信誉分 100
可用分 1131
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
1

发表于 2011-12-15 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]大鼠乳鼠心肌细胞培养

[求助]大鼠乳鼠心肌细胞培养



我最近刚开始做乳鼠心肌细胞培养，做了好几次都不成功，一是收获的细胞数太少，二是细胞活力太低，不能搏动，心中抑郁，不知何故，希望大家好心能帮我分析一下原因。在此多谢了！
1，取10只乳鼠
2， 消化酶 “混合胶原酶+胰酶”浓度分别为0.06%，0.1%， 3，消化 第一次加3ml消化液10分钟，弃上清，但发现此时上清很粘稠，难以吸取
4，第二次加消化液3ml消化8分钟，吸取上清时亦难以取出，仅少量，于是再消化，时间再缩短至5，4，3分钟，反复消化直至组织完全溶解。因为上清难取，每次都取长达2-3分钟
5，离心 1000转*10分钟，弃上清，未完全丢弃，管底预留约1ml液体。
6，收获细胞数量不多，只能养在两个50ml培养瓶中。
7，用DMEM+20%胎牛血清（国产）培养基
8，2小时差速贴壁分离
9，48，72小时后仍没有发现心肌细胞跳动，却发现很多死细胞碎片



[ 本帖最后由 雪山飞鹿 于 2011-12-15 16:16 编辑 ]
顶部
glass[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76223
精华 0
积分 715
帖子 1109
信誉分 100
可用分 6373
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
2

发表于 2011-12-15 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没做过，等别的战友看看消化是否有问题。
顶部
abc816[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77362
精华 0
积分 775
帖子 1190
信誉分 100
可用分 6817
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
3

发表于 2011-12-15 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先十只乳鼠，不知道你杀和取心的速度，如果时间久也可以导致心肌细胞状态。
第二感觉你取心可能不是太好，把心脏根部白色的组织全剪了，而且你剪心肌可能太碎，否则不会开始就是粘稠。
胶原酶浓度太高，降到0.4%
顶部
乌贼老弟[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74586
精华 0
积分 336
帖子 411
信誉分 100
可用分 2791
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
4

发表于 2011-12-15 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果碰到粘稠的情况,建议你在密封的管子里面使劲摇将之摇散,不然你会损失很多细胞
10只乳鼠起码都可以养3个75的培养瓶,看来你确实浪费了不少细胞.
离心要彻底,因为胶原酶不能被血清中和,虽然胶原酶对细胞的破坏比较小,但也不要忽视,它会影响贴壁的效率.
顶部
yychen[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77452
精华 0
积分 516
帖子 751
信誉分 100
可用分 4495
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
5

发表于 2011-12-15 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
混合胶原酶是什么酶和什么酶的混合？
顶部
雪山飞鹿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79771
精华 0
积分 153
帖子 85
信誉分 100
可用分 1131
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
6

发表于 2011-12-15 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很感谢大家！
胶原酶是买的1型和2型的混合酶，刚开始时是用的单纯2型胶原酶浓度也是0.06%，但是培养的心肌细胞贴壁不好，不跳动。所以就更换了。
我考虑是消化过度的问题，但是要组织消化完全，只能慢慢来，一般10只我用2个小时。
另外请大家帮我参考下用的胰酶的浓度高么？
离心管里离心后，要把液体都要倒掉，还是要保留1ml左右，以免细胞损失？
再次表示感谢！
顶部
乌贼老弟[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74586
精华 0
积分 336
帖子 411
信誉分 100
可用分 2791
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
7

发表于 2011-12-15 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #6 雪山飞鹿 的帖子

如果是2型,就配0.08%左右就可以了
你的消化时间明显过长,还是那个问题,摇动不充分,你要充分摇动的话你会发现细胞其实很容易消化
我建议你保留1毫升左右
胰酶浓度我用的0.125%.两者1:1体积混合
顶部
雪山飞鹿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79771
精华 0
积分 153
帖子 85
信誉分 100
可用分 1131
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
8

发表于 2011-12-15 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好的！我照你所说方法试试！
我确实在消化过程中只是轻轻摇动。害怕细胞在摇动中损伤，可能是过于小心了才是消化时间过长。
酶的浓度就暂不更换，估计是***作的问题！
另外再问下：我用的是低糖的DMEM培养基，这是否也影响细胞生长？
顶部
乌贼老弟[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74586
精华 0
积分 336
帖子 411
信誉分 100
可用分 2791
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
9

发表于 2011-12-15 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #8 雪山飞鹿 的帖子

最好用高糖,细胞初始生长阶段糖很重要
但低糖似乎也不影响,因为我两者都用过,几乎没有什么区别
顶部
爱老虎游tt[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79001
精华 0
积分 284
帖子 288
信誉分 100
可用分 2211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-6
状态 离线
10

发表于 2011-12-15 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我现在做的也是乳鼠心肌细胞的培养，经历了半年的是失败现在我可以充满自信的说乳鼠心肌细胞培养的技术我已经掌握了。个人感觉还是你的消化吹打问题，而不是胰酶或胶原酶的问题，我一直用的都是0.08%的胰酶。就是买来的国产0.25%的胰酶。每一毫升的胰酶加两毫升的PBS，最终浓度大约为0.08%。细胞一直长的不错。关键还是你消化吹打的问题。你是用吹打管直接吹打消化心肌组织还是在恒温振荡水浴箱中消化或者用磁力搅拌器搅拌消化呢，原来我消化心肌细胞时是在青霉素小瓶中剪碎，洗干净后就直接加入胰腺酶消化。最多消化3次，且每次时间只有短短的4分钟后青霉素小瓶中的心肌细胞就变成胶冻状了，连上清都没办法吸出，得到的细胞很少。后来把磁力搅拌器用上了，情况就好了很多，首先消化次数增加了，10只乳鼠能消化10几次左右，每次的消化时间大约为8分钟。得到的细胞也很多，搏动情况也很好。个人感觉如果用吹打管吹打消化的话一个是消化液与心肌组织不能充分混匀消化，打个不太合适的比喻，就像用洗衣服时用手洗和洗衣机洗的道理是一样的，你可以试着用一下磁力搅拌器看情况能否好转，祝顺利。
顶部
 55  1/6 123456››