[讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结

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标题:[讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结 (转载)

看到很多同学在问关于RAW264.7细胞的一些问题，基于我对该细胞一年的培养经历和以前我发的贴，现在索性总结一下关于该细胞的经验以及注意事项，希望能对大家有所帮助！
培养条件：1640培养液+四季青10%新生牛血清。PH：2gNaHCO3每1L 1640培养液。

在我培养的过程中，从来没有用过胰酶消化传代。我一直是直接用弯嘴滴管吹打的。只要按照顺序一片片地吹打，很容易就能够把该细胞吹打下来。吹打一遍之后，置镜下观察哪里还有未吹下的细胞，再着重吹打。吹打过程中，注意用力，要比常规稍加力度以能够吹下细胞。当然，用胰酶消化也是可以的，但是细胞的生长状态就是没有不用直接吹打下来的好。

对于RAW264.7细胞，他的生长时喜欢扎堆的。正常的生长状态应该是一小片一小片地生长。片片之间不连接，等到长的更多更密的时候就会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。一般，在细胞小片小片地铺满瓶底而未连成大片的时候就该传代了。并且一旦有片细胞叠加成层就要进行传代。否则该处细胞必老化。影响整体生长状态！

该细胞的生长速度比较快，常规留种下，一般3-4天传代。有时生长旺盛的时候甚至2天就需要传代，所以在你传新瓶的时候，尽量少留种，我们在平时维持的时候，一般都是只在新瓶里用滴管口蘸一下而已。能够维持4-5天再传代。如果是一次性大塑料瓶，则可以维持7天左右。过节假日时可以用此方法维持。

RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形或多边形，伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。

RAW264.7细胞生长速度非常得快，贴壁速度很快，对生长空间的要求比较敏感。所以传代的时候以及培养的时候都要注意不要太多的细胞在培养瓶里，这样细胞状态会比较好。很多反而不利于该细胞生长。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该把我好该细胞喜欢的生长空间密度。

对于细胞生长状态不好的时候，可以采取“二传”的方法，是我在另一帖子里写到的，现在转述如下：

【对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：

首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）

其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。

如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。】

RAW264.7细胞本身就会呈不规则状的多边形，所以当细胞呈现这种形状的时候，不必大惊小怪，在培养瓶里多数细胞呈现出此种形状之时，其实就是提示你他的生长状态即将趋于不好了，有些老化了，该传代或者优化筛选了。

暂时总结这么多，后面有想到的会继续补充！另外一篇帖子“如何把细胞养的更漂亮！”大家可以补充着看。祝各位好运！

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

总结的不错！
以前我也养过，是用细胞刮刀将细胞刮下后传代，感觉不是很满意！下次试试LZ的方法！

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #2 乌贼老弟的帖子

怎么你们都觉得这么难传代呢，还用细胞刮？我真的只是每次直接吹打的，按照顺序一点点地吹打觉得很好传代啊。

@STAR@[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

啊的，在做原代的单核巨噬细胞的培养。
现在RAW264.7的细胞是不是到处都有啊？我们实验室没呢。。。。

园丁##[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

买一个又不贵的，细胞这个东西不是细菌，建议还是别蹭别人的，到头来吃亏的是自己。替老板省别的也别省这个钱。

二丫头466[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很详细哦，谢谢分享！

老化的细胞或者成层的细胞再传，会变好吗？谢谢！

loli[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #6 二丫头466 的帖子

细胞一旦老化成层再传下去不会再好了。我养过的好几种细胞都是这样，包裹RAW。

loli[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于RAW264.7细胞，他的生长时喜欢扎堆的。正常的生长状态应该是一小片一小片地生长。片片之间不连接，等到长的更多更密的时候就会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。一般，在细胞小片小片地铺满瓶底而未连成大片的时候就该传代了。并且一旦有片细胞叠加成层就要进行传代。否则该处细胞必老化。影响整体生长状态！

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成片生长是因为传代的时候太稀了。传代密度稍微高一点就很均匀。

一般100mm dish 1:4 OR 1:5传代比较合适。

园丁##[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

根据细胞的本能学术:肥大等细胞遇冷有释放炎症介质的本能,炎症介质有引起组织不同程度变性的本能,组织的不同程度的变性.可诱发白细胞的不同程度的自杀性攻击的本能出现!

所以临床各种不同的炎症就出现!

高于体温的外热如喝热水,能诱发血细胞的御热本能出现!肺大等免疫细胞与白细胞及吞噬细胞御热释放胞内热液,并邹缩减少面积而御热自保而进攻态停止而休息的储能态开始.这就是中医喝热水治疗外感发烧的原理!

abc816[使用道具]
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发表于 2011-12-15 16:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很有意思。我伺候巨噬细胞RAW264.7快8年了，从来都没有觉得这个细胞容易消化，直接吹打更是只能吹下很少量的细胞。理论上看，巨噬细胞是容易贴壁、贴壁很牢的细胞，我做腹腔巨噬细胞培养就是用贴壁法排除杂细胞，所以我认为能够直接吹打下来的细胞应该恰好说明是状态不是最好的巨噬细胞。我从来都是用胰酶消化细胞，放在孵箱中3-5 min后再吹打，很多文献也都是使用这种方法。
关于老化的问题，我赞成，也有教训。巨噬细胞RAW264.7一定不能太满，否则老化，对LPS等的刺激也不敏感了，所以我从来都是较稀的传代、铺孔做实验。以后再交流，很有收获的。