小中大[求助]我的原代培养步骤，请大家指教！
[求助]我的原代培养步骤，请大家指教！
参考文献：细胞培养书及部分文献
个人的步骤，仅供参考
并请有经验的DX给点意见！
一、取材
1. 超净工作台内，麻醉老鼠，开腹，找到已经形成的癌组织，避开有坏死和污染的部位，尽量从肿瘤组织深部取材。
2. 将上述组织用含有双抗（青霉素200-1000U/ml、链霉素500ug/ml）及两性霉素（2ug/ml）的培养液浸泡漂洗20分钟，并用无血清培养液反复冲洗干净。
3. 用眼科剪去除组织块中的脂肪、神经组织、结缔组织和坏死组织。
二、组织块分离
1. 剪切分离：将经过修整和冲洗的组织块放入小玻璃皿中，用眼科剪反复剪切，直至全部形成大约1mm3体积的小块，剪切过程中需要保持组织块湿润。将剪切好的组织块放入培养瓶中，均匀摆放，小块间距以0.5cm左右为宜，每个50m培养瓶大约放置30-60块。组织块放好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入适量培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜倒置在37℃、含5% CO2的细胞培养箱内。2-4小时后，待组织块贴附于培养瓶上以后，将培养瓶翻转平放，静置培养。（加入少量D-Hanks液，反复吹打。低速离心后，弃上清，加入含血清的培养基反复吹打后，移入培养瓶培养。）
2. 消化分离：将组织块切成1mm3体积的小块，加入50倍体积组织量并预热到37℃的胰蛋白酶。放在恒温水浴锅中，每5min摇动一次，共20-30min。消化结束后，将消化液和细胞经过100目孔径不锈钢网滤过，除去未消化的大块组织。800rpm低速离心3min后弃上清，用D-hanks液洗1-2次。最后，细胞记数，按5x105－1x106/ml接种培养瓶。（分次消化法：在0.1%的胰酶浓度下，每次消化时间不长于10min，重复多次，可以减轻对单个细胞的损伤）
三、去除成纤维细胞
1. 反复贴壁法（差速贴壁法）：倒去旧培养液，用Hank′s液洗3次，然后加入消化液（0.2%EDTA+0.25%胰蛋白酶），37℃10min，镜下可见成纤维细胞成圆形，癌细胞维持原状。吸出消化液，加Hank′s液吹打细胞使成纤维细胞脱落，吸出旧液，组织块和癌细胞团用Hank′s液轻轻漂洗3次。加入培养液CO2孵箱，37℃，每周换液1次，处理1次。
2. 血清浓度，上皮细胞耐受低血清环境的能力较强，而成纤维细胞的耐受力较差，利用这个差异，用含1.5%血清的培养液可以降低培养物中成纤维细胞的生长。
四、形态学观察
1. 相差显微镜：观察原代细胞生长状况，并将具有特征性的状态照相保存。
2. 光学显微镜：细胞爬片后，进行常规HE染色和细胞角蛋白免疫组化染色。
3. 电子显微镜：将培养瓶中的细胞用细胞刮刮下，离心沉淀后，细胞团用2.5%戊二醛及1%锇酸双固定，Epon812包埋，制成超薄切片，染色，在透射电镜下观察。将细胞爬片形成单层细胞的盖玻片用2.5%戊二醛及1%锇酸双固定、梯度酒精脱水、置换、干燥及喷金，用扫描电镜观察。
五、细胞生长动力学
1. 细胞生长曲线：经计数后，将细胞分别接种于21-30个大小一致的培养瓶中，每瓶中细胞总数要求一致，加入培养液的量也需要一致。每天取出3瓶细胞进行计数，计算均值。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘成细胞的生长曲线。（将细胞接种于35mm小培养皿中，接种细胞量1x104细胞/皿，置于C02培养箱培养。每天随机取3皿，用0.25%胰酶将细胞消化下来，经台盼蓝染色计数活细胞，连续10天，绘制细胞生长曲线。）
2. 细胞分裂指数：将细胞接种于事先放置有小盖玻片的培养皿中，接种细胞量1x104细胞/皿，置于C02培养箱培养。每天随机取1片，丙酮与甲醇固定，常规HE染色、封片，光学显微镜下观察。选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞，进行细胞计数。对每个玻片各取细胞数多、中、少三个区域各一区，共计数1000个细胞中的分裂相，计算出每千个细胞中分裂相平均数值和所占百分比，并按时间顺序绘制细胞分裂指数曲线图。
3. 倍增时间：根据生长曲线，利用公式计算倍增时间。
六、细胞生物性状鉴定
1. 细胞核型分析：取对数生长细胞2瓶，加入浓度为0.04μg/ml的秋水仙素，37℃、5% CO2孵育2h，吸出培养液，用0.25%胰酶消化细胞，离心1500rpm，8min，弃上清，加入0.075mol/L的KCL溶液，37℃水浴20min，离心弃上清，加入新鲜配置的固定液（甲醇：冰醋酸＝3:1），室温固定10min，离心后弃上清，重复固定一次，滴片，室温干燥，进行G显带，计数100个分裂中期的染色体，进行核型分析，并拍照。建系后需要取不同代数的细胞制备染色体标本，分析细胞代数与染色体变异的关系。
2. 软琼脂培养：先将5%琼脂溶化后与9份预温37℃的新鲜培养基混合均匀，浇入24孔培养板中，0.8ml/孔，置室温待琼脂凝固。取对数生长期细胞，制成1x103细胞/ml的细胞悬液。取细胞悬液9.4ml与0.6ml 5%琼脂混合，配成0.3%琼脂培养基，立刻浇入铺有底层琼脂的24孔培养板中，0.8ml/孔，使第一行每孔100个细胞，第二行50个细胞，第三行25个细胞，将培养板移入CO2培养箱，置于37℃、5% CO2剂饱和湿度环境下培养，2周左右可见克隆形成，计算集落形成率。
3. 裸鼠致瘤试验：取对数生长期细胞，制成细胞悬液分别接种10只裸鼠，接种量1x106-5x106细胞/只。观察成瘤率、肿瘤潜伏期及肿瘤生长曲线。当直径达到1cm以上时，照相后处死，取出肿块作病理组织学检查，常规HE染色切片照相。
