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标题:[讨论帖]肝星状细胞原代培养方法及trouble-shooting

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发表于 2011-12-16 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[讨论帖]肝星状细胞原代培养方法及trouble-shooting

[讨论帖]肝星状细胞原代培养方法及trouble-shooting


由于近期收到一些群友们关于肝星状细胞的pm. 特发此贴, 便于大家讨论及学习. 谢谢

请参考下面2个帖子, 是去年开始学习肝星状细胞时发的帖子
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=12033417&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#12033417')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=12860230&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1286023')
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发表于 2011-12-16 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

过多的血细胞是不是影响HSC的提取啊？

答: 如果一开始灌流肝脏时灌流成功的话, 不会残留太多的血细胞(肝脏的颜色会变成乳白色). 而如果发现肝脏还是红色, 或者后面取完细胞后, 镜下发现有较多的血细胞, 是否可以理解为前面的灌流那一步操作不好? 而如果灌流做的不好(消化不完全)会直接影响HSCs的得率.

因此, 建议再好好设定好灌流的条件.
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发表于 2011-12-16 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们用PERCOLL提取的，效果很不好，没有清楚的分层，问下老师用过PERCOLL提过吗？要怎样处理好些呢

答: percoll我没有做过, 我說說optiprep的经验. 原理上离心分层是由于不同浓度的optiprep的密度不同, 而hsc又是最轻的细胞而会漂浮到上层. 分层不清很有可能是由于加上不同密度的离心液(比如,我就是加15%和11.5%的optiprep和GBSS)时, 由于速度过快引起了几个层之间的液体被混匀在一起.(我一般加3层液,会花上5分钟左右)

因此, 建议加不同密度的离心液时,一定要非常缓慢的加.
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发表于 2011-12-16 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分离小鼠HSC细胞时，用的DNAse酶是哪个公司的，你说solution II里含20mg/l的DNAse,我上网查了一下，sigma公司的500ug 就要1890元，如果按您的浓度一只小鼠就要需要600ug的DNAse 了，所以能否跟您确认一下您的DNAse，

答: DNase加入的目的,在于清除在消化过程中被破坏的大量的肝细胞(hepatocyte)中被释放出来的genome. 因为genome带有粘性, 会把细胞们黏在一起,这样的话在过滤(100μm 左右的筛子)清除垃圾时, hsc也会被黏在一起而被阻挡, 这样会直接影响hsc的得率. 还有一点是各个公司的不同批号的DNase的作用力会不同, 具体使用量还得预实验中摸索.

因此, 建议通过几次预实验, 掌握好DNase的使用量.
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发表于 2011-12-16 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
达人，请问您的灌注系统是如何构建的？直接用血管夹固定注射器针头,那恒流泵的管子又是如何与注射器连接的呢？多谢啦
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发表于 2011-12-16 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好

1. 我的灌注系统, 其实是我们组其他人用来心脏体外灌注用的泵. 只不过由于我仅仅是需要恒速灌流而已, 所以被我拿过来使用.

2. 注射针头的固定, 我也是一开始用血管夹的, 但是由来发现血管夹夹住后有缝隙, 灌流液会反向流出来. 因此后来我都是将门脉分离后, 用手术线直接结扎的

3. 管子是直接连到注射器, 由于大小尺寸不合适, 我是用封口膜将缝隙堵死了.
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发表于 2011-12-16 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
OPTIPREP配置有哪些需要注意的事项？

答: 需要注意的地方有几点
1. 尽量现配现用
2. 虽然我的配方是15%和11.5% 但是实际上我会下面的稍微重一下, 上面的稍微轻
一下, 这样对提高纯度有一些帮助 (或许是心理作用?)
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发表于 2011-12-16 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分离过程中最关键的步骤是哪一步？.

答: 我倒觉得所有的步骤都是最关键的. 因为是一环一环影响着的.
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发表于 2011-12-16 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如何避免污染?

答: 首先, 每个试剂该0.22过滤的过滤, 该高压的高压. 但是我的经验是在我的protocol当中, solution1不用可以灭菌, 常规配置就可以;而solutionII 是一定要0.22过滤的(因为含有glucose, 所以不能高压).

其他的就按照常规无菌操作即可.
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发表于 2011-12-16 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教下
1.灌流的时候，是否结扎上腔静脉或者下腔静脉？
2.一只小鼠肝脏分离的细胞够吗？
3.最后一步吸取GBSS和11.5%OPTIPREP的中间层后，450G离心8MIN后，能否看到沉淀？
谢谢！！
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