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标题:[求助]关于MTT测药物半抑制率的困惑

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[求助]关于MTT测药物半抑制率的困惑

[求助]关于MTT测药物半抑制率的困惑



关于MTT我有很多很多困惑,请各位高手解答一二
1,看文献有说490nm,又说测570nm的OD值的。经过在园子里学习,说是如果是DMSO溶解就是用490nm,但各处说法都是不一样的。是否是哪一个都可以?还是哪个更好?
2,加药后测IC50是24小时后测?但如果我这个细胞本身长的比较慢,24小时对药物都没反应,怎么办?能否72小时后测?
3,如果是测生长曲线,测个6天的。隔天换液?还要加药?
4,OD值是在2以下就很好,还是在1以下?我实验室的师姐都是做2以下就ok
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1、无论你用什么溶解,要想判断自己所测波合适否,只要取部份最后的溶解液上紫外上作个扫描,自己酶标仪的波长是否在紫外吸收峰的范围中,如果在峰值,那OD值就大,如果不在峰值,则OD值就小,如果在峰谷,测不适合测OD值。
2、OD值当然需要有个范围,一般来讲,对于MTT法,OD值在0.2-1.0范围是比较好的,走出此范畴可能与细胞数就不成线性了,也就不能正确反映药物的作用了
3、IC50的测量时间由你药物对细胞的作用而定,太短太长多不好,一般药物在24-72小时间,当然也有例外的。你镜下观察一下在什么时间段不同药物浓度下细胞的差异最大,此时即为最合适的测量时间
4、细胞生长曲线其实与测IC50差不多,就是连续在五段时间内测量正常及药物作用后细胞的OD值,以OD值对时间作条曲线,至曲线平台为止。
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+小生怕怕+[使用道具]
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1 第一条可以详细讲讲么?能否举例讲?我比较笨,怕误解你的意思
2,如果超过1的话,是否就可能是细胞数过多或者作用时间过长??大概有大些原因需要注意?
3,谢谢,这个我懂了
4,因为生长曲线也是要加药的,要不要隔天换液呢?不隔天换液,培养基营养被消耗了,细胞生长差,不能反应药物的作用啊。

还有一个问题:测细胞生长曲线的目的是什么?
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关于MTT测量波长的问题,我以前也疑惑过。后来看了Roche一个MTT Kit的说明书,上面有一幅MTT吸收波长的图,MTT大概在500-600nm波长附近都有很高的吸收值,所以在此范围内的波长都可以用来检测。而有些酶标仪在此范围内只有490nm可以用,所以有些文献是用490nm波长检测的。我现在手头没有那张说明书所以不能说的很准确,你可以试着去Roche网站上搜一下。

关于OD值,就像fishbody战友所说,在0.2-1之间才有比较好的线性关系。如果按标准步骤在加入MTT4小时后加DMSO溶解,OD超过1就是因为活细胞过多。通常可以靠铺板时少铺些细胞来解决。

测生长曲线的目的是观察你药物的作用效果和作用时间呀
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1,看文献有说490nm,又说测570nm的OD值的。经过在园子里学习,说是如果是DMSO溶解就是用490nm,但各处说法都是不一样的。是否是哪一个都可以?还是哪个更好?

570的灵敏度会比490高,因为MTT的波长峰在这个范围

2,加药后测IC50是24小时后测?但如果我这个细胞本身长的比较慢,24小时对药物都没反应,怎么办?能否72小时后测?

药物反应慢的话肯定要延长检测时间啦,但是要考虑营养是否能跟的上(这跟你种板的细胞数量和培养基决定),我们实验室现在做的一般都是72、96h检测
3,如果是测生长曲线,测个6天的。隔天换液?还要加药?

测生长曲线就是看细胞本身的生长情况,不用加药,加药反而影响了细胞的正常生长;你可以同时做一个换液组和不换液组的对照,种板细胞数量多的话,6天应该是要换液的,换液不用太勤,会对细胞产生搅动影响,保证能提供足够的营养就可以

4,OD值是在2以下就很好,还是在1以下?我实验室的师姐都是做2以下就ok

OD值在2以下都是可以的,0.2~1.2之间的线性关系会更好一些。
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1、举例说,如果你用DMSO溶解的,测取此溶解液到紫外仪上进行扫描,一般取200-800nm波长范围,即可以得到该物质的吸收峰,此吸收峰中的波长即为你可以使用的波长。
2、如果OD值超过1,可能是细胞数过多,也可能是MTT作用时间过长,也有可能是MTT作用后上清吸弃不完全引起的
4、在做加药的生长曲线的同时,肯定要做个不加药的对照,这样数据才有说服力。如果要换液两者同时换喽。
5、其实生长曲线 我们做得很少。它应该反映的是药物对细胞增殖能力的影响吧。
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谢谢大家,获益匪浅
我为新手,即将做MTT实验,在实验思路上很多都理不清楚。
请教另外实验室做MTT的师兄后,他们在做量效的时候,也就是做细胞加药后生长曲线变化的时候,用的是2%的血清培养基。

1,说是如果血清过高,很快1,2天细胞就长满了。绝对不可以用10%血清。
2,在加药前要血清饥饿24小时,使细胞达到周期同步化
3,我想问细胞计数是否一定要每次都做?保证每次都细胞铺板数差不多?太痛苦了,实验室毕业的师姐说她都没做过,每次都是细胞长满后铺3,4块96孔板
4,铺板时,各位怎么保证每孔细胞数都差不多。我每加一行,用枪使劲的吹啊吹!!! 但是心里又怕细胞都被我吹死了。

问题越来越多,请各位见谅,我实在是啥都不知道。实验室已经没人做细胞实验了。
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1、不同的细胞其生长速度是不一样的,对血清的要求也可能不一样,不是有一部份细胞是要用胎牛血清的吗。
2、细胞周期同步化对于一般细胞增殖试验好象用不着吧。除非你要考察药物对某一特定周期细胞的作用。而且细胞同步化的方法有多种,如4度培养过夜。
3、每次细胞铺板当然要尽可能一样,如果连细胞读数都不想做,你还做什么细胞试验。
4、不用每加一行就吹。现在铺板可用排枪,铺一块板中间吹一次就够了,除非你的细胞沉得特快。
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现在又想到了一个超级重要,同时超级弱智的问题:
每个实验方法里都提到使药物终浓度为多少多少。我对这个不能理解。我的理解有两种。举例说:
1,96孔细胞培养板细胞接种,每孔200μl。空白组不加细胞,加入200μl培养液。然后药物配置终浓度为10ug/ml, 8ug/ml, 6ug/ml.4ug/ml 2ug/ml. 将各种浓度的药加入96孔板,每孔10μl。

2,还是96孔板细胞培养板细胞接种,每孔200μl。然后加药时换夜。配置培养基加药,使加药后的培养基药物浓度分别为10ug/ml, 8ug/ml, 6ug/ml.4ug/ml 2ug/ml。然后加入各孔,96孔板每孔200μl.

就是这个药物终浓度到底是什么意思??是最后每孔的药品终浓度么?
我倾向于2,但在园子里学习时看见有的人做的是1.
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4、不用每加一行就吹。现在铺板可用排枪,铺一块板中间吹一次就够了,除非你的细胞沉得特快。

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我们没有排枪。
细胞计数板也很烂,看不清楚。哦,我知道要每次都计数了。保证每次铺板的每孔细胞数不要相差太多。
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