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标题:[求助]请教有关G418筛选的问题

junjie05[使用道具]
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发表于 2011-12-17 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教有关G418筛选的问题

[求助]请教有关G418筛选的问题


请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，如何用G418筛选？我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系？
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一叶[使用道具]
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发表于 2011-12-17 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
２。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。
３。即是有G41抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。

行了吗？？？

祝你好运！！！
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junjie05[使用道具]
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发表于 2011-12-17 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 一叶 的帖子

非常感谢！请问：能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗？
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一叶[使用道具]
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发表于 2011-12-17 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，
目的蛋白表达有的多，有的少，
外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，
在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，
长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，
转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。
所以，要进行单克隆化操作，
使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，
也是对高表达细胞的保护。
操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留２００cell左右就可以进行该操作了，
该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，
我就不赘述了。

必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，
我前十代都是这样的，
结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。
现在很多代了，很稳定。

好了吗？
祝你好运！！
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junjie05[使用道具]
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发表于 2011-12-17 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这可能也是目前国际上最详细的有关G418正确筛选的资料了：），由此看来以前很多文献（包括国外文献）都是扯淡。非常非常感谢！！！
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junjie05[使用道具]
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发表于 2011-12-17 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一叶学兄，您好。今天仔细研究了您讲的话，又有了两个新问题，希望能再次得到您的指教。
1。我的质粒中含有SV40与neo基因，好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。
2。按您的讲法，筛选要进行10代，那么维持剂量要进行多长时间？如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗？
3。在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养基中存在G418对细胞是否有影响？
4。既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响？

再次感谢！！！
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一叶[使用道具]
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发表于 2011-12-17 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。
２。那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓１００个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢？应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？用刚才的例子来说，如果我们抓着５个红球，另一次抓着１０个红球，可以肯定，的二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。

３。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。

４。neo的产物是酶，过高的G４１８浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。

５。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。

   仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

   强烈要求加分两分，本贴实属吐血原创之作，还从来没告诉过别人呢。不过从数论的角度理解分子生物，也不知合适不合适。还望诸位大侠指点一二
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发表于 2011-12-17 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合发生在活性转录染色质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位点，可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制，增强瞬时表达，有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说，即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。
２。关于概率论的思维，我认为红球和黄球的比喻很形象，但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁，并不是完全相互独立的。

关于G418的用量，应该与抗性基因的表达量在一定范围内有正比关系。哺乳动物细胞的我不太清楚，但毕赤酵母的高拷贝筛选是利用了抗性基因的剂量效应关系。
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guagua[使用道具]
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发表于 2011-12-17 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是做转染重组的，但不是NEO 和G418筛选。从两位高人的指点中学到很多， 我是一个新手。 以后有这方面的问题还得请高人施教。
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发表于 2011-12-17 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实,G418筛选转基因细胞操作还算简便.
但单克隆培养较难,特别是对于从原代分离的有限细胞系.96孔板稀释法操作简便,但克隆效率很低,因此还可以尝试套环分离法.
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