细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [讨论帖]总结了一下支原体感染和细胞小黑点的问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:[讨论帖]总结了一下支原体感染和细胞小黑点的问题

二丫头466[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74070
精华 0
积分 266
帖子 272
信誉分 100
可用分 2101
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
1
 

[讨论帖]总结了一下支原体感染和细胞小黑点的问题

[讨论帖]总结了一下支原体感染和细胞小黑点的问题         (转载)


最近我养细胞发现小黑点现象很严重,原来对“黑胶虫”一说嗤之以鼻,认为那不过是自欺欺人的借口,觉得怎么也不会发生在自己身上。但是真的就碰上了:要来的细胞传代以后就出现细胞间黑点,细胞空泡化,很多类似凋亡、坏死的细胞,最终细胞漂浮,完全死亡。

上述现象很像所谓的“黑胶虫”。

我感觉实际是支原体感染以后细胞生长不好造成的碎片和感染原虫的混合体。

这种现象的直接原因是支原体等原虫感染,间接表象是小黑点,被以讹传讹成为了“黑胶虫”。

光镜下看不到支原体,但是可以看到支原体感染的终末现象——细胞凋亡坏死,释放出大量碎片,看起来就像小黑虫子。

查找类似的帖子——

很多人是更换血清后出现这种问题;
说空气传播的可能是一个培养箱的人都用了同一种血清,而不是可以通过培养箱空气传播;
感染最可能是牛源性的支原体,通过产道或血行感染,所以兽用的泰乐菌素比较有效。

用plasmocin等抗支原体的药物有效;
用巨噬细胞共培养有效(吞噬支原体);
很多人更换进口血清就好了。

感染也有个疾病谱,在质和量上从低烈度到高烈度,
所谓“细胞生长不受影响”,其实是感染的烈度不高而已;
烈度高的感染就出现细胞大量空泡形成,细胞间空旷地带出现大量黑点,细胞最终凋亡、坏死,漂起来。

有些国产血清写着建议灭活,其实是挂羊头卖狗肉,那个56度30分钟更多的是为了杀杀支原体的。实际上也有杀不死的。但可以降低产品的风险。

我用阿奇霉素(有针对支原体衣原体功效)75-100ug/ml的浓度洗了细胞和加入培养基中,小黑点确实明显抑制。不过我想根治就很难了。据说invivogen公司的plasmocin可以根治,不过就成本来说不如直接更换血清。

以上是自己个人总结的一点看法。建议不要总拿子虚乌有的“黑胶虫”来说事。多考虑看不到的支原体,不要还停留在培根时代——只相信自己眼睛看见的。
顶部
爱老虎游tt[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79001
精华 0
积分 284
帖子 288
信誉分 100
可用分 2211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-6
状态 离线
2
 

回复 #1 二丫头466 的帖子

你很确定吗?实验证实过吗?我遇到相同的问题了,怀疑以前冻存的细胞也被污染了。原因无从找起...
顶部
二丫头466[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74070
精华 0
积分 266
帖子 272
信誉分 100
可用分 2101
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
3
 

回复 #2 爱老虎游tt 的帖子

用了抗支原体的药,可以显示抑制的趋势,但是加大用量,细胞就死了。

我已经停了实验,因为实验室有其他人也污染了,污染的同学用的是我做细胞时,只打开过一次的枪头。他原来还好好的,用了枪头就出现了相同的状况,接着复苏细胞也是出现了相同的状况。我们所有共用过的东西只有这个枪头,还有培养箱。

我的枪头只在超净台打开过一次,他接着用就出了问题。(枪头是axygen带滤芯的原装枪头,还高压过的)。

我的猜测:支原体可以形成气溶胶,这是通过空气传播的理论解释基础。理论上也可以通过培养箱或超净台内空气气溶胶传播。

(一般说来,半径小于1微米的粒子,大都是由气体到微粒的成核、凝结、凝聚等过程所生成;而较大的粒子,则是由固体和液体的破裂等机械过程所形成。它们在结构上可以是均相的,也可以是多相的。已生成的气溶胶在大气中仍然有可能再参加大气的化学反应或物理过程。 液体气溶胶微粒一般呈球形,固体微粒则形状不规则,其半径一般为 10-3~102微米。粒径在10-1~101微米的气溶胶在大气光学、大气辐射、大气化学、大气污染和云物理学等方面具有重要作用。   小粒径气溶胶的浓度受凝聚作用所限制,而大粒子的浓度则受沉降作用所限制。微粒在大气中沉降的过程中, 受的阻力和重力的作用达到平衡时, 各种粒子的沉降速度不同。)
顶部
二丫头466[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74070
精华 0
积分 266
帖子 272
信誉分 100
可用分 2101
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
4
 

支原体需要和细胞共生,需要细胞膜提供胆固醇,支原体趴在细胞表面生长。电镜下看,就像“麻元”——欢喜坨外面撒一层芝麻。污染严重时,光镜下是可以间接看到大体现象的。
下一步准备做一下支原体特异的PCR,准备合成引物。
顶部
乌贼老弟[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74586
精华 0
积分 336
帖子 411
信誉分 100
可用分 2791
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
5
 
黑胶虫没碰到的时候,大家都不承认,但是见识过之后才知道,有些东西不是我们能解释的。
开始的时候,细胞间只是见到黑点一样的杂质,细胞状态一般,如果勤换液,能维持住细胞状态,但是只要发现做布朗运动的黑点,那么细胞的寿命也就到头了。我们尝试过各种方法,以下方法略微有些作用:
1、勤换培养液。最好是一天一换,虽然影响细胞生长,但是能挽救他们的生命。
2、每次传代的时候离心,1000转以上。每次离心可以大量的减少杂质,细胞状态明显好转。
3、早传,早冻,多留火种。每次复苏的细胞开始几天状态都还是可以的,这样很多试验抓紧时间就可以完成了!
另外,很多同学倾向于是支原体感染,但是我们用过抗支原体的方法,效果一般。其实还有最重要的一点,用心养细胞,别当作是负担,彼此多熟悉,时间长了,摸准它的脾气,就好对付了!!!

这是以前讨论黑胶虫的帖子,希望对大家有帮助!
cuturl('http://cell.dxy.cn/bbs/topic/5938528')
顶部
二丫头466[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74070
精华 0
积分 266
帖子 272
信誉分 100
可用分 2101
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
6
 
解释不了就弄个子虚乌有的东西出来膜拜,不是鸵鸟政策么。

国外回来的教授上课讲为什么要经常冻存时,原因之一,提到国内的培养环境,不可能完全避免支原体污染,1个月以上就经常感染。表面上看就是细胞状态越来越不好。
顶部
二丫头466[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74070
精华 0
积分 266
帖子 272
信誉分 100
可用分 2101
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
7
 
我准备PCR之后克隆测序,看看是不是牛源性的莱氏无胆甾原体。
估计到明年出结果了。
顶部
小鱼鱼[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73389
精华 0
积分 276
帖子 331
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
8
 

最近细胞长的一直不好,共用的培养箱也污染了,不知道怎么回事!郁闷
顶部
二丫头466[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74070
精华 0
积分 266
帖子 272
信誉分 100
可用分 2101
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
9
 

四季青的批号为100419的胎牛(无支原体)血清最好别用,我知道就有几个中标的。
顶部
二丫头466[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74070
精华 0
积分 266
帖子 272
信誉分 100
可用分 2101
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
10
 
PCR结果是支原体阳性的。

采集的标本是消化过的细胞,离心后弃上清,常规提取DNA,用支原体16s和23s之间的区段为目的片段,第一轮PCR,巢式引物的外层引物对就已经扩增很亮的条带。

(支原体附着在细胞表面,通过特异膜蛋白附着,所以扩增培养液上清和扩增离心洗涤后的细胞提取的DNA都可以)

目前PCR产物送公司克隆测序,看是不是动物源性的支原体。
顶部