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标题:[求助]测定ros空白对照值超高

eric930[使用道具]
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[求助]测定ros空白对照值超高

[求助]测定ros空白对照值超高


我用碧云天的活性氧试剂盒检测药物作用悬浮的HL-60细胞后ros水平,具体操作为:
1、取2*107细胞,离心后重悬与DCFH-DA 500ul中,作用20分钟,期间每隔2-3分钟颠倒混匀;
2、用无血清培养基洗细胞3次;
3、加入1.5ml无血清培养基,分为3份
4、第1份为空白对照,即不再加入任何药物;
第2份加入碧云天试剂盒中自带的阳性对照rosup
第3份加入实验药物
5、在孵箱内作用30分钟,重悬于PBS 500ul当中检测
结果显示:
1、空白对照可以检测到阳性染色细胞91.3%
2、阳性对照阳性染色细胞93.1%
3、药物刺激反而降低到89.3%
预期的实验结果是空白对照阳性率极低,药物刺激后阳性细胞明显增多,请做过的朋友指导一下,万分感谢,十分紧急!
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pengke1983[使用道具]
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我不明白的是你为什么是先标记荧光染料,再加刺激?
你是在什么地方看到是这种做法的,有相关文献支持吗?
一般情况下,都是先培养刺激,刺激完成后各组再加入荧光染料上机检测的。
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eric930[使用道具]
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回复 #2 pengke1983 的帖子

谢谢你的回答,我用的是碧云天的ros试剂盒,说明书上写的对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞,先装载探针,后用活性氧阳性对照或药物进行刺激细胞。我在文献上确实没看到过这种做法,一些国外的文章都是先培养刺激的。您觉得背景高与这个操作的过程有关吗,我可以试试先刺激细胞吗
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eric930[使用道具]
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谢谢,我明天就试试,您觉得我加DCFH-DA作用的时间和加入的量用不用在缩短一些呢
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eric930[使用道具]
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我今天又按照先加药物刺激后进行染色处理了,这回出现了奇怪的现象,首先背景还是很高,90%多,并且各个实验组都出现了2团细胞,原来都是1团,这是怎么回事呢,请帮帮我,急呀
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eric930[使用道具]
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这是空白对照的结果


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eric930[使用道具]
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这是阳性对照的结果


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eric930[使用道具]
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我查文献看到别人做的HL-60水平是低的呀,我重复了3次都是这样的结果,谢谢你呀,请问2团细胞说明什么呢
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bongte[使用道具]
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很简单,这样的情况是流式检测老师的错误:
1.他按照常规操作将没染色的细胞信号作为空白对照调阴性置信区,然后与你的染色空白管比对的结果,但在DCFH检测方法中,仅需将你染色的空白管(没处理,染色)作为阴性对照调节荧光信号,并将该管的荧光信号主峰置于直方图中间位置,这样不管你的实验时抑制还是促进均能反应出来。注:不染色的空白细胞可不用,即使要用也仅作为FSC和SSC电压调节用,不作为荧光信号调节。
2.DCFH 是ROS 的俘获剂,空白对照细胞内正常成在ROS,一经染色同样具有较高的荧光细胞,故不能用不染色的空白细胞作为阴性对照,否则将出现你这样的结果,荧光主峰右偏,不便你实验结果分析,特别是促进实验。
祝实验顺利!
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eric930[使用道具]
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太感谢你们了!真是太高兴了,没有你们的帮助我真是很难走出这个困扰,我还想请问一下平均荧光强度是我图中那个xmean值吗,我在文献中看到是以均数加减标准差的形式表现的,请问是怎么得到的呢?感激,感激!
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