小中大[求助]HepG2细胞复苏
[求助]HepG2细胞复苏
最近一直在复苏HepG2,但是细胞24H后几乎不贴壁。反复调整复苏条件，均失败。我的复苏步骤如下：
第一次：准备一支离心管，该离心管已装有2ml含有20%FBS的温热完全培养基。从液氮中取出冻存管并迅速放入37℃水浴中不断搅动冻存管直至液体全部液化(60s内)，拿至细胞培养间，75%乙醇消毒冻存管表面。（操作应尽可能快以免冰晶形成，并防止在融化过程中水浴锅的水浸过冻存管口）。打开冻存管，用1ml枪移出融化的细胞悬液于1中准备好的离心管中。滴加10倍以上的培养液，1000r/min,5min，弃上清。（细胞用新鲜的培养基洗涤以除去残存的DMSO，，混合后低速离心，重复用培养液洗一次。）用小体积的培养基约1ml吹打细胞，移入至培养瓶，加合适体积的培养基。
第二次：将离心条件更改为1000r/min,90s
第三次：冻存管放在37度水浴锅约10分钟，不离心，直接将冻存液加入已有合适体积的培养基的培养瓶中，余步骤同前
第四次：冻存管放入37度水浴锅约10分钟，离心去除冻存液，再加入合适体积的培养基的培养瓶中，余步骤同前
第五次：冻存管放在40度水浴锅约3分钟，静置2分钟左右，直接将冻存液加入培养基中，余步骤同前
第六次：冻存管放在40度水浴锅约3分钟，静置2分钟左右，1000r/min,5min,去除冻存液，加入培养基重悬，余步骤同前。
排除培养基污染等，这么多次复苏均以失败告终，其中第三次复苏细胞24h一开始贴壁很多，但是细胞贴壁状态不好，贴壁缓慢，并且培养基中漂浮很多看着既像气泡又可能是细胞碎片的东西，换液之后，能够去除这些东西，但是第二天就再会出现这种东西，第三天就会很多。但是细胞状态极为不好，细胞生长极为缓慢，甚至不生长，有回缩的迹象。
其余的复苏细胞几乎24h后看不到贴壁，全部为死细胞。
培养基用的是DMEM高糖培养基，血清浓度20%。培养基已用其它细胞株，其它细胞长势很好。
第三次第五次均用25cm2培养瓶，其余用的是75cm2培养瓶，排除细胞污染。
因为没有用台盼蓝染色看看，不知道复苏完之后是不是当时细胞就已经死了。细胞冻存的密度和比例不知道，复苏的细胞用的批次也不一样。
请各位看看我这个细胞到底复苏问题出在哪里？给点建议。
