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标题:[求助]牛乳腺上皮细胞培养,无血清DMEM/F12饥饿培养24h后...

jrwyyplt[使用道具]
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[求助]牛乳腺上皮细胞培养,无血清DMEM/F12饥饿培养24h后...

[求助]牛乳腺上皮细胞培养,无血清DMEM/F12饥饿培养24h后,细胞还能增殖吗?   (转载)


奶牛乳腺上皮细胞培养,研究IGFs对细胞增殖等性状的影响,用无血清DMEM/F12饥饿培养24h后,细胞继续DMEM/F12培养7d作为阴性对照,两天换一次液,设立多个时点进行MTT检测绘制生长曲线,结果24h内曲线呈直线,但在48h开始有较明显增殖,进入生长曲线的上升阶段,与药物处理组趋势相同,且差异不大。据我所知,此时无血清条件下培养的细胞应该是在G0期,没道理增殖,至少不应该有这么明显的增殖。

请大家帮忙分析一下原因,实验操作中或设计中是否存在可能导致该现象的问题,如果认为是正常现象的话请说明原因。
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盼盼[使用道具]
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原代分离的细胞吗?正常有血清状况下生长是怎样的?需要多少时间贴壁,以及细胞的倍增时间大概是多久?
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jrwyyplt[使用道具]
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回复 #2 盼盼 的帖子

非原代,冻存复苏的细胞,24h之内贴壁,贴壁后对数生长期期开始饥饿的!细胞没长满不存在接触抑制的问题,血清恢复的同步对照没做。
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jrwyyplt[使用道具]
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问题补充:楼上的朋友问倍增时间,是不是想比较无血清和有血清倍增时间,看差异大小?可我的疑问在于饥饿状态下的细胞不死就不错了,应该不会明显增殖,倍增时间应该很长,曲线应该比较平,但现在对照组(DMEM/F12)显示与添加了生长因子的细胞生长曲线类似,在24h饥饿后继续培养的前24~48h的平滑曲线后,有较明显的上升段。
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园丁##[使用道具]
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抛一下砖。
starvation的效果视细胞种类不同而不同。之前做过肝癌细胞HepG2的starvation,无血清状态下25%-confluent用了4天时间,比有血清的情况晚了一天。做了一些后续试验,HepG2细胞的一些adherence associated protein的分泌要比普通细胞强,所以无血清条件下贴壁和抱团生长不受太大影响。HepG自身分泌的grow factor和cytokine没有测定,但我的臆断是在DMEM环境下,HepG2自身能够分泌供其生长的物质。
这个回答对你的疑惑是否有点帮助?
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jrwyyplt[使用道具]
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回复 #5 园丁## 的帖子

楼上的意思是说他做肝癌细胞时,饥饿后DMEM对照组和实验组生长曲线类似,对吧,这是癌细胞,有没有做过正常组织细胞的,给个说法!血清饥饿应该做的人挺多的,对照组也是必需设置的啊,不一定是DMEM培养,其他基础培养基也行,有没有获得与我实验现象类似的?谢楼上,我也考虑过可能只是正常现象,或许是饥饿后细胞同步了,前24~48h没有分裂,所以MTT检测呈直线,当生长到一定时期,时间长短取决于细胞类型,细胞同时分裂,MTT检测数值增加的就比较明显了。因为设置的时间点也是不连续的,12h、24h、48h、72h,或许在某个期间发生了质变。看了一些血清恢复的文章,也提到细胞虽然进入G1期、S期,但进入M期需要时间,所以前期检测不到明显增殖。

但以上仅是个人分析,那只是个传说!缺少实例支持,希望有实践经验(包括听来的)的大侠们踊跃参与讨论,你们的唾沫星子也是对我的滋润啊!
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园丁##[使用道具]
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回复 #6 jrwyyplt 的帖子

对照组就是加了不同浓度FBS的HepG2。正常细胞是没有做过,但是细胞分裂的原理都应该相同。增值细胞的情况,如果过了G1期,进入S期以后,细胞顺理成章地准备进入G2和M期了。

我不是研究细胞生物的,查阅的资料也很有限,都是百度百科上看的。以下是原文:

"G1期的长短之所以变化很大,与G1期内存在一个校正点或阻止点(简称R点)有关。R点主要控制 G1期时间的长短。通过了此点,细胞就能以正常速度不受外界条件的影响而完成细胞周期的其他时期。因此,有人认为细胞的生长是在G1期R点上停止的,例如当细胞内环腺苷酸(cAMP)水平增高,细胞密度增加时,可阻止细胞从G1期向S期过渡,用嘌呤霉素抑制蛋白质合成或用放射线菌素D抑制RNA合成,也能延缓细胞从G1期进入S期。

有人发现 G1期内能合成一种有触发作用的蛋白质;它是不稳定的,极易被分解,故称为v蛋白。v蛋白在G1细胞中达到一定水平时,细胞便可通过R点进入S期。 "

"已发现很多体内因素可以激发或抑制细胞的增殖,例如多种激素、血清因子、多胺、蛋白水解酶、神经氨酶、cAMP、cGMP以及甘油二脂(DG)、 三磷酸肌醇(1P3)和Ca信使系统等等。 细胞内cAMP浓度增加对细胞增殖有抑制作用,凡能使细胞内cAMP增高的因素都能抑制细胞的增殖,降低细胞生长速度;反之,凡能使细胞内cAMP含量下降的因素都能促进DNA的合成与细胞的增殖。"

"细胞周期也受机体调节系统的影响,例如肝再生就是由调节系统的作用加速肝细胞增殖。但是肿瘤细胞,由于宿主失去对它的调控,因而恶性增殖。"

那么多内容再抛一下砖,总结一下。如果是增殖性的体细胞,体外培养无血清的情况下,DMEM high glucose内一些成分协同细胞内部调控,一段时间后细胞内的cAMP、cGMP水平达到一个较低的水平,细胞由G1进入s期,进而有丝分裂。

这个话题挺有意思,之前我们实验室一个研究员也跟我讨论过这个问题,结果HepG的实验结果的确是有点让人吃惊的。今天没什么时间了,明天去实验室再好好补习一下相关知识。
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园丁##[使用道具]
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附上DMEM high glucose的成分表,
DMEM(H) 细胞培养基(粉末型)成分  


查看积分策略说明
附件
2012-1-4 11:06
DMEM(H).jpg (66.04 KB)
 
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园丁##[使用道具]
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其中的氯化钙、D-泛酸钙、肌醇 、叶酸、烟酰胺 等可能对starvation时的细胞有促进分裂作用,纯属臆断,看帖的园友可以随意抛砖。
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jrwyyplt[使用道具]
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你的很有道理。实验不是我一个人做的,有些细节我也不是很清楚,我们做一个血清恢复实验(有血清对照)就好了!饥饿前的有血清细胞生长曲线我再研究一下。只要对照组和有血清的差异较大,我也就不纠结了!
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