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怎样降低MTT法实验过程中的各种影响因素
MTT原理
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以经溶剂溶解后用酶标仪在570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值间接反映活细胞的数目。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
MTT法的实验操作步骤看似简单，但在学习的过程中才发现，要想得到可信而漂亮的检测结果并不是那么容易。在不断的摸索和老师的指导下，终于得到了满意的结果。在这里，我对该实验具体操作中遇到的问题进行了归纳总结。
影响因素及解决办法：
一、 影响复孔重复性的因素：
MTT法通常是在96孔板中种上细胞，然后分不同的组给药，设置对照组，以检测药物对细胞的增殖影响。设复孔的目的是对实验结果可信度的一个有效监测办法。因为复孔间的差异越小，说明操作越精确。结果的可信度也越高。那么是哪些因素影响复孔的重复性呢？
首先，应该是孔间细胞是否均匀，只有在每孔的细胞数量尽可能一致的情况下才能建立起后续试验的可信基础。保证细胞种得均匀主要靠熟练的操作，细节上是在种板的过程中，每种5到6个孔需将细胞悬液吹打几次，因为细胞在重力作用下有下沉的趋势。一般我们是设3~6个复孔，竖行排列，这样方便种板和计算。可能的情况下，多些复孔检测作用会好些。
其次，是“边际效应”，96孔板放在37℃孵箱中孵育细胞的过程中，周边孔内液体容易挥发，测定数据与中心孔有较大出入，所以周边一圈通常不种细胞而只加PBS,另外得注意保持培养箱的湿度条件。
