细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [讨论帖]揭秘细胞培养中出现的“亮点”

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 24  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[讨论帖]揭秘细胞培养中出现的“亮点”

HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
1

发表于 2012-1-7 08:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[讨论帖]揭秘细胞培养中出现的“亮点”

[讨论帖]揭秘细胞培养中出现的“亮点”        （转载）


也许各位群友都遇到过：细胞株细胞传代多了，或者某次操作失当(比如换了个新手帮忙照看下细胞)以后，经常出现一种现象——亮点。

这种“亮点”，不是污染，但消化后又可以贴壁，很难消除。出现之后，短时间内，细胞或许影响不大，但时间长了，亮点越聚越多，就会影响细胞生长，尤其会影响爬片的细胞状态和后续各类染色的观察。“亮点”增多的同时，往往异型化的细胞增多，缓慢生长的细胞增多，难消化的细胞增多。

写本文前搜索以前的帖子，发现很多细胞培养都遇到这种“亮点”，但都没有对其提出比较明确的区分和解决办法。说实话，我也不太明白它到底是什么，其产生的决定性因素是什么，又该如何根治。不过，养细胞这么多年，也遇到过它，并积累了一些经验，现分享出来，作为引玉之砖，欢迎大家讨论。

“亮点”，是什么样的呢？


查看积分策略说明
附件
2012-1-7 08:49
21568737.jpg (262.54 KB)
 
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
2

发表于 2012-1-7 08:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上面图中红色圈中的，就是“亮点”。(p.s. 这张是HUVEC，本来考虑下文，应该用HBZY-1的，结果处理之前忘了拍片，大家凑和看一下吧，样子一样的)
“亮点”在镜下看就是一个亮点，中央略暗，可能出现在细胞间隙，也可能在细胞中，贴壁，结构不清晰，但边界较清楚。

从形态和位置看，“亮点”应该是细胞死亡或者凋亡产生，与细胞培养过程中细胞过密、消化过度、吹打太剧烈等有关，甚至二氧化碳浓度、pH值也可能有关。
到底是什么，怎样产生的，还请大家补充和纠正。

重点是，“亮点”，如果清除呢？我有办法。

具体做法是，先用冷(4度)PBS荡洗细胞2-3次，以充分洗掉血清和上清中可能的漂浮物

→低浓度(0.125%)冷(4度)胰酶消化，轻轻晃动细胞瓶，同时镜下观察，时间自己掌握，以正常细胞开始变圆变亮为度。

我以HBZY-1为例(刚好有实习生养坏了的一瓶细胞)，下图显示消化过程中，不少“亮点”(红色圈内)和状态稍差、贴壁不牢的细胞(黄色圈内)被消化下来，漂浮在上清中。而图中此时下面的大量细胞都刚刚开始有消化的迹象，为避免处理过度，我到此为止了。


查看积分策略说明
附件
2012-1-7 08:50
17900073.jpg (107.28 KB)
 
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
3

发表于 2012-1-7 08:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
→ 冷PBS反复荡洗，直至瓶中再无消化下来的“亮点”和细胞。

→ 继续用冷胰酶(恢复到正常消化浓度0.25%)消化细胞。

下图为此时消化中的HBZY-1细胞。


查看积分策略说明
附件
2012-1-7 08:50
97714528.jpg (279.24 KB)
 
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
4

发表于 2012-1-7 08:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
→ 倒掉胰酶，加上培养基，轻轻吹打，每个区域一次就够。低速离心5分钟。

下图为吹打过后，残留状态不好的细胞和顽固“亮点”。图中小黑点为细胞碎片。


→ 然后根据细胞数量，传代。



查看积分策略说明
附件
2012-1-7 08:51
80050992.jpg (56.44 KB)
 
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
5

发表于 2012-1-7 08:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
→ 4到8小时后，取出刚传代的细胞，镜下观察，如有细胞贴壁，立即换液，把现在还没贴壁的通通丢掉。
下图中为贴壁6小时后的HBZY-1，部分“亮点”未贴壁。


查看积分策略说明
附件
2012-1-7 08:51
46268670.jpg (71.2 KB)
 
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
6

发表于 2012-1-7 08:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下图为换液后，“亮点”少了很多。（还有细胞碎片未除掉，不是本贴关注内容，不讨论）


多做几次这样的操作，“亮点”，也许仍无法根除，但至少，再也不会满视野亮晶晶，而染色好的细胞爬片中，再也不会出现“找不到一个细胞干干净净的视野”的情况出现。


查看积分策略说明
附件
2012-1-7 08:52
60041286.jpg (105.14 KB)
 
顶部
小野花[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76741
精华 1
积分 299
帖子 293
信誉分 102
可用分 2211
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
7

发表于 2012-1-7 08:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我养的细胞是自己原代培养的乳腺上皮细胞，一般养到十几代就开始出现大片的亮点，而且细胞很难再正常传代下去，应该是细胞本身的问题，这个亮点如何去除，我还没有按你说的方法试过，可能想要拍片的时候会这样处理,那请问亮点对细胞生长有什么不好的地方？就是你这样处理后的细胞无论是细胞形态还是增殖都会改善吗？
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
8

发表于 2012-1-7 08:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #7 小野花 的帖子

原代细胞传十几代了肯定会很难再传。一般3-8代用来做实验。

你可以用这个方法试试,应该会好一些，不过,因为是原代,改善可能不会很大。

因为这种亮点还可以贴壁，可以认为具有活细胞的某种特性，是否会释放对细胞生长不利的物质暂且不说，光是占着正常细胞生长的位置就不好了，而且有亮点的细胞，在消化和生长中，的确不如没有亮点的细胞，所以，应该是有对细胞有害的物质释放的。
顶部
缘yuan[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72882
精华 0
积分 218
帖子 176
信誉分 100
可用分 1626
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
9

发表于 2012-1-7 08:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您这个细胞间隙中的黑点是什么？
细胞代谢的杂质么？
在镜下是否活动？
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
10

发表于 2012-1-7 08:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #9 缘yuan 的帖子

细胞碎片，不活动，也不会增加。
因为是实习生把细胞养成这么多亮点和碎片的，拿来做教程正合适。
细胞碎片的除去本贴不讨论，所以没有除去。
顶部
 24  1/3 123››