[讨论帖]我的一点小鼠T淋巴细胞分离的经验（尼龙毛柱法）

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标题:[讨论帖]我的一点小鼠T淋巴细胞分离的经验（尼龙毛柱法）

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发表于 2012-1-7 09:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[讨论帖]我的一点小鼠T淋巴细胞分离的经验（尼龙毛柱法）

各位兄弟姐妹，我的实验打算提取小鼠脾脏的T淋巴细胞进行培养，过去的一个多月来按师兄曾经使用过的尼龙毛柱法做了4次试验，耗费C57小鼠8只，摸索了一些经验来和大家分享，希望大家指正帮助。
首先说尼龙毛我们使用的是师兄剩下的日本WAKO公司的，每包2克，1盒5包，基本够用了。我把1包2克尼龙毛从包装里取出来后尽量拆碎，挺费劲的。然后使用去离子水煮沸这包毛20分钟，再放置20分钟冷却，共重复6次，目的是经过反复的煮沸使尼龙毛尽量蓬松伸展能更好的吸附B细胞。
其次把煮沸过的尼龙毛放入烤箱烤干，约4小时。待尼龙毛完全干燥后再次将其仔细撕至单纤维状态，越细越好。我是把这些尼龙毛小心仔细的填入了10毫升的一次性注射器针筒里。0。5克尼龙毛大约能装1只柱子，体积约6-7毫升，注意松紧适中，这非常重要。事实证明一次性注射器针筒上高压灭菌完全没问题。
无菌状态取小鼠脾脏2只，如下图

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2012-1-7 09:14

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发表于 2012-1-7 09:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

然后将脾脏剪碎

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2012-1-7 09:15

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发表于 2012-1-7 09:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在200目细胞筛上适度研磨，尽量使用玻璃注射器针芯，使用一次性注射器针芯可能会将部分黑色塑料研成细小的黑渣滓混入细胞中，很难看。研磨力度要适中

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2012-1-7 09:15

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发表于 2012-1-7 09:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

被培养基冲洗过细胞筛进入平皿收集了的细胞混悬液加入红细胞裂解液约2毫升裂解2分钟

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2012-1-7 09:15

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发表于 2012-1-7 09:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

离心后再次使用10%的1640洗涤细胞一次后离心去上清
最先应该使用37度的培养基浸泡尼龙毛柱20分钟。该尼龙毛柱的支架是我自己设计的，一高一矮，矮的用于加注细胞混悬液后置于37度培养箱孵育1小时只用，太大了培养箱放不下。高的用于在超净台内分离细胞用。2种支架都是我画了个图让手巧的师弟用实验室的现成材料纯手工DIY的，简洁实用。给个超净台内紫外线灭菌后的特写。

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2012-1-7 09:16

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发表于 2012-1-7 09:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顺便说下，支架上的塑料夹子是我在超市买的，平均4毛一个。
最关键的在于上图中我自制的控制滴速的“阀门”。是用输血器拼接成的，主要是因为输血器比较粗，但是控制滴速在每分钟1滴还是很困难的。我们基本上让它在每45秒1滴就行了，随着柱子内溶液的减少，滴速会自然放慢。在漫长的分离T细胞的过程中（3-5毫升的混悬液大概要滴3小时）没几十分钟就要观察它一次，以防出现事故。有一次我们就太大意了，针头末端自己弹出了15毫升离心管流到台面上了我们还不知道，最后浪费了大约四分之三的细胞，导致细胞密度过低培养失败。痛心呀。

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发表于 2012-1-7 09:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最终我们使用2只小鼠的脾脏大约分离出了1乘10的7次方的T细胞，加入1.5毫升培养基，置于小培养瓶中培养，同时培养基中含有200U/ml浓度的rhIL-2。再说一下，人的白介二可以用于小鼠的T培养扩增，但是不如小鼠的白介二效果好。但小鼠的白介二却万万不能用于人的T细胞培养。看看我们当天分离出的T细胞图片吧。做这么点实验实在是难为我这个原来只会管病人开刀的外科大夫了，版主给加分吧!

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2012-1-7 09:18

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