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标题:[求助]人皮肤原代成纤维细胞培养中的问题

wmp1234[使用道具]
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[求助]人皮肤原代成纤维细胞培养中的问题

[求助]人皮肤原代成纤维细胞培养中的问题



我现在做成纤维细胞培养,由于没有方便的标本,采用的是乳腺处的皮肤,不知道有没有影响.
我用胶原酶消化2h后,还有许多絮状纤维的物质,细胞离心后贴壁的都是原形的细胞.获得的成纤维细胞很少.是不是纤维细胞都还没有消化出来?
又用低浓度的胶原酶消化过夜,絮状纤维的物质减少很多,细胞活性80%,但是
贴壁的还都是原形的细胞,获得的成纤维细胞还是很少.
.
采取组织块培养法10天部分组织块细胞才爬出来,而且细胞数量也很少
不知道,我出了什么问题,麻烦大家了
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提点建议:
 首先关于皮源问题,乳腺处的皮肤是肯定没有问题的,但是关键是取材后要在短时间内处理,如果放置时间过长会影响细胞的活性或者造成污染,实际上我推荐使用成人的包皮来做,取材方便,又很多。
 关于消化的步骤,培养人皮肤的成纤维细胞首先要把表皮层去掉,不然角质细胞会影响试验,具体方法就是皮肤消毒,切除皮下组织后用0.25%的胰酶4度过夜消化,第二天早上可以很方便的刮下表皮。然后用胶原酶消化真皮层,37度两小时也可以,4度过夜也行。(用胰酶消化也可以,但是效果没有胶原酶好),然后用刀背挤压消化过的皮肤,然后用单层纱布过滤一下,这样就可以得到足够的细胞了,培养液用1640或者DMEM完培都可以,一周原代就可以融合了。(记住血清不能中和胶原酶的活性,只能采取稀释的方法)
 最后,不推荐使用组织块法培养成纤维细胞。
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wmp1234[使用道具]
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谢谢
我皮肤取材时间比较及时
由于皮肤比较松弛,我是用剪子把表皮剪去了

现在主要的问题是为什么收集的成纤维细胞很少
缺少了刮取的步骤?
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白白的[使用道具]
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首先确定你剪去的只是表皮,而没有连真皮层一起剪掉,一般表皮层是正常皮肤的颜色,而真皮层是白色的,一定要注意。
 其次皮下组织最好在消化前切除干净,因为这些东西会严重影响消化的效果。
 保证胶原酶是有效的,这点很重要,浓度也不要太高,我们推荐一般是
0.1%-0.2%左右,4度过夜比较好。
 还有就是消化完一定要挤压,胶原酶只是降解部分细胞外基质,细胞不会自动跑出来,只是比较容易出来,要用镊子或者刀背什么的把细胞挤压出来,最好在经过单层纱布过滤一下,这样絮状的物质会少点。
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lixi559[使用道具]
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皮肤原代成纤维细胞培养。
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wmp1234[使用道具]
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回复 #5 lixi559 的帖子

十分感谢

我现在把脂肪组织祛除了
如何区分真皮层和皮下组织呢?
看了图谱,可是还是不大明白具体的操作
谢谢
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说通俗点,看上去软软的就是皮下组织,一般都是用手术刀和镊子来操作的,正常情况下你是不会把真皮层和表皮层分开的,也就是说你只要尽量把那些软绵绵的组织切掉就可以了,皮肤用胰酶消化过,第二天很容易把真皮和表皮分开,这时表皮下白色的就是真皮层了。
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caihong[使用道具]
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能给一个详细的皮肤原代成纤维细胞培养的protocol吗,我也是要做相关研究的?
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yjf1026[使用道具]
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提点建议:
 首先关于皮源问题,乳腺处的皮肤是肯定没有问题的,但是关键是取材后要在短时间内处理,如果放置时间过长会影响细胞的活性或者造成污染,实际上我推荐使用成人的包皮来做,取材方便,又很多。
 关于消化的步骤,培养人皮肤的成纤维细胞首先要把表皮层去掉,不然角质细胞会影响试验,具体方法就是皮肤消毒,切除皮下组织后用0.25%的胰酶4度过夜消化,第二天早上可以很方便的刮下表皮。然后用胶原酶消化真皮层,37度两小时也可以,4度过夜也行。(用胰酶消化也可以,但是效果没有胶原酶好),然后用刀背挤压消化过的皮肤,然后用单层纱布过滤一下,这样就可以得到足够的细胞了,培养液用1640或者DMEM完培都可以,一周原代就可以融合了。(记住血清不能中和胶原酶的活性,只能采取稀释的方法)
 最后,不推荐使用组织块法培养成纤维细胞。

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使用组织块法培养成纤维细胞有什么问题吗?
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生物迷[使用道具]
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同问,我做粘膜成纤维细胞原代能用组织块法吗?
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