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标题:[求助]LIPOFECTAMINE 2000转染问题若干

windy+++[使用道具]
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发表于 2012-1-14 12:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]LIPOFECTAMINE 2000转染问题若干



LIPOFECTAMINE 2000应该是比较公认的好的转染试剂，周围很多人都在用。我是第一次用。
当然，在用之前，我就咨询了实验室里的师兄师姐和师妹。综合前人的经验如下：
1. 细胞铺板后24小时左右开始转染（理由：这是细胞已经贴壁，且处在增殖期，有利于外源DNA的表达，而且，说明书上也是建议转染前24小时铺板）。
2.接种细胞的密度尽量高一点（理由：这样可以得到高的转染效率）。
3.转染后4~6小时换培养基（理由：LIPOFECTAMINE 2000对细胞有毒性）。
4.体系中的所有成分减半，包括：每孔培养液的体积，DNA和LIPOFECTAMINE 2000的量。但是，最终每孔中DNA和LIPOFECTAMINE 2000的浓度和说明书上推荐的是一致的。（理由：这样可以节省资源）

第一次做，我严格按照说明说的要求，并按照前人的经验。但是现在看来还是出问题了：

铺板24小时后，293细胞基本都贴壁了，但是状态不佳——本来应该有突起的细胞，还没有长突起。但是我还是硬着头皮做了转染，同时做了两空对照——一个是没有加DNA和LIPOFECTAMINE 2000，但是加了用来稀释DNA和LIPOFECTAMINE 2000的OPTI-MEM;一个是只加了LIPOFECTAMINE 2000，没有加DNA。
6小时后，所有孔，我都换了新鲜的培养基。

现在48小时过去了，第一个对照孔（没有加DNA和LIPOFECTAMINE 2000），细胞长的很好；第二个对照孔（只加了LIPOFECTAMINE 2000，没有加DNA），细胞状态差点；其他同时加DNA和LIPOFECTAMINE 2000的，细胞状态极差，有很多细胞都飘起来了。

以上的结果可以证明LIPOFECTAMINE 2000是有细胞毒性的——而不是向invitrogen宣传的那样。对我这样的实验结果，我的思考如下：

1.因为铺板24小时后，细胞状态还不是很好，是否可以考虑，等到细胞状态很好时再转染？

2.这次转染的细胞，我继续培养，如果三天后，转染的细胞长起来了，我是否可以继续往后做（比如做WB检测）？但是，转染后这么长时间，转进去的质粒会不会被细胞内的核酸酶破坏掉了？ 其表达的蛋白会不会也被破坏了？

3.有没有必要专门做个实验，来摸索LIPOFECTAMINE 2000和DNA的量？

4.大家能否给点建议？多谢！

顺祝群友们龙年快乐，实验顺利！
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-1-14 12:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不一定要铺板后24小时转染,转染时机的标准应该是细胞丰度适中和状态佳. 铺板后三天转染都没有问题的.
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-1-14 12:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我不同意"铺板后三天转染都没有问题"
总体来说,细胞长三天后转染,对转染效率会有影响的,因为细胞状态不如小于48小时的状态好.

我的体会:
接种密度要合适,不能过稀;
lip2000的毒性不是很大,大多时候是我们转入的载体影响细胞的正常生长;这有时与载体的纯化质量有关,也与转染的载体量有关.
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发表于 2012-1-14 12:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人认为lip2000的毒性比较大，转染后细胞状态不好与此有很大关系。
可尝试将lip2000量减低。用EGFP转，摸个最低用量。
说明书推荐的剂量一般都是比较大的，你用得多，公司才卖得多，才赚得多，所以没必要花冤枉钱。只要用的量够把足够多质粒转进去就可以了。

质粒就不必吝啬了吧，和lip2000相比，成本相去甚远。

等细胞状态好的时候种板，而不是种板后再等细胞状态改善。一定要保证每次实验处于同等条件，这样你的实验才有重复性。

种板后24h内转染是最合适的，长点问题也不大，但个人认为不要超过48h，毕竟贴壁生长不同时间的细胞状态是不一样的，必须要保证实验的可重复性。
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吴才子[使用道具]
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发表于 2012-1-14 12:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚做的转染,(做RNA干扰,用质粒作为载体,三条针对目的基因,一条无关序列)和楼主说的问题是一样的,我做了(只加了LIPOFECTAMINE 2000，没有加DNA)对照,细胞一直长的很好,其它四组加了载体的细胞状态极差,24小时后细胞死亡一半,到第4天细胞所剩无几了,个人认为载体影响比lip2000对细胞影响更大,现在正在减少载体的量摸索实验条件,明日观察结果!
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-1-14 12:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现在的LIPOFECTAMINE 2000可以在有血清状态在转染了,大家试过么?怎么样?
我刚刚作了,后天出结果告诉大家
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发表于 2012-1-14 12:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

lipo2000还是挺毒的，如果用量在10ul以上对细胞的毒性就很明显了。
我一般4h左右就要换液，细胞就不会浮起来，转染效率也不低。
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白白的[使用道具]
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发表于 2012-1-14 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
给大家汇报下结果
前天提蛋白，昨天跑WB，今天显色。发现我的转染的细胞，目的蛋白表达了，量还比较大。对照组，没有一点信号。
看样子这样做是可以转的。因为这是第一次做，也算是摸条件。
我准备下次做的时候，细胞铺板密度提高一倍，铺板后40小时转染，然后lipo2000的量稍减一点——六孔板，每孔4ul。质粒每孔2ug。我想这样不会有什么问题了。呵呵
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克隆鱼[使用道具]
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发表于 2012-1-14 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #8 白白的 的帖子

4.体系中的所有成分减半，包括：每孔培养液的体积，DNA和LIPOFECTAMINE 2000的量。但是，最终每孔中DNA和LIPOFECTAMINE 2000的浓度和说明书上推荐的是一致的。（理由：这样可以节省资源）

浓度是一致的，可是质粒的绝对数量是减半的啊，这样是不是也可能降低转染效率呢？

你有没有预转染过荧光蛋白质粒 ，这样可以较为方便的判断转染 成功与否及其转染效率呢？

大家有用LIPOFECTAMINE 2000转染2215细胞的吗 ？转染效率最高能达到多少啊？最近刚做了两次预转染，结果不是特别理想！
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月牙牙[使用道具]
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发表于 2012-1-14 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

汇报结果：
用LIPOFECTAMINE 2000有血清状态下转染293T细胞，不换液，48H后收集细胞，准备做WB。用GFP做效率对比，，感觉不错（见图），约60%-70%被转染成功。
心得体会：
1、LIPOFECTAMINE 2000现在可以在有血清的状态下转染，省力。
2、质粒用量不能按说明上来，eg,10UL的LIPOFECTAMINE 2000加4UG的质粒根本达不到效果，至少要6－8UG质粒才可保证明显的结果（因为我的蛋白分子量大，约250KD）。
3、视细胞死亡情况看换液与否。我与技术支持联系过，他们说每一个批号的LIPOFECTAMINE 2000毒性有差别，要视情况而定是否换液。
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