小中大筛选时的培养液
加药筛选约6天左右,细胞会大量死亡,孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题:1, 死亡的细胞会裂解释放出有害物质,导致那些有neo表达的阳性细胞死亡,即非选择性死亡,因此要及时换液
2 ,孔中细胞数目很少,细胞之间的信号会变得很弱,也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液:假如你要转染3T3细胞,在3T3细胞汇合度达到80%的时候,换液,培养过夜之后收集培养液,通过滤器消毒,和新鲜的培养液按1:1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
3,适当增加血清浓度。
筛选时出现的问题及其解决办法:
1, 问题1。做hela细胞的筛选,现在已经筛选3周,在6孔板中已经长出一些细胞簇,想把它挑到96孔板中,就用2ul胰酶消化,在消化过程中,胰酶扩散,细胞已经四散开,和周围的其它细胞簇融合在一起(我的细胞簇离的很近),就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起,那样根本没有办法做下去了,该怎么办?
a、可以减少胰酶量;胰酶在加入之前要用37度温箱预热,并且PBS润洗细胞层,以减少可能残存的血清的影响;
b、加入胰酶后,稍过几秒钟就可以吸走消化液了,不用吸干净,然后放到37度温箱中继续作用1MIN,这时,消化酶可以继续作用的,又可避免胰酶扩散;
c、显微镜下观察细胞完全松散开,就可以在你感兴趣的局部加培养基,并吸走你的可隆了呀
d、具体消化的时间,你注意摸索一下,如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开,可以再重复的,直到松散开,能够被吸走为止。
我的建议:1、在100mm dish中挑克隆,细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化下来,在96孔板中逐步稀释获得单克隆
2,问题2。筛选成功的概率:只要有抗性加压筛选,挑选到的机率还是比较大的。一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70-80%,但是想挑到表达量高且能稳定表达的,不大容易。这个可能是在染色体上,合适的整合位点太少的缘故。
3,问题3。细胞形态的改变:稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态的改变。
想请教各位有经验的高手,你们做稳定转染时有此发现吗?我的也是,而且好象还有好几种不同类型的细胞。不过,我转的是一种抑癌基因。
4,问题4。单克隆化的时机和个数:加药筛选时, 一般等到确认的转染细胞长到70%以上时,再做有限稀释法, 以克隆出阳性细胞, 同时要保持适当的药物浓度,以防突变和污染。若细胞长好了,如有40%以上,就可以有限稀释了一般,筛选5,6个克隆就有需要的克隆,但保险起见,筛10个吧。
5,从单克隆化时开始,就要加大营养,清和生长因子。
单克隆化的操作方法;
1.方法1。单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。培养SPC-A1(人肺癌细胞),转染了EGFP,然后进行了G418抗性筛选和96孔板单克隆筛选,最终获得了成功将我的实验步骤写出来,希望对你有所帮助。
2.方法2。实验步骤大致为:预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的细胞培养液,0.1ml/孔,并放于细胞培养箱中温育,然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞,细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液,上述细胞液接种于96孔板的第一排,0.2ml/孔,从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排,混合后,从第二排中吸取0.1ml接种于第三排……,一直到第八排,最后一排都丢弃0.1ml细胞液,操作示意图见下图。一般来说,每一列都会有某个孔中只有1~2个细胞。
3.方法3。我的改进之处:我在显微镜下观察,标记孔中小于10个细胞的孔,然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住,然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死,这样留在孔中的就是单克隆了,通过这样的,我一共获得了6株单克隆。但需注意的是:时间不能超过30min,否则细胞极容易死亡。解决操作时间长的方法:拿一个96板,在里面随便种一些细胞,然后用牙签练习,我练了5~6次后非常熟练了
培养液:最好是含15%的胎牛血清,加大营养,有利于细胞生长;另外一种方法是对还没有变黄的细胞液进行过滤,过滤后的培养含有很多生长因子,可以作为单克隆的培养液。