[讨论帖]关于transwell实验的最新问题

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标题:[讨论帖]关于transwell实验的最新问题

loli[使用道具]
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发表于 2012-1-17 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

参阅国内外文献，在做肿瘤细胞迁移实验的细胞药物处理方面，发现方法各异，有如下方法：
—--
1.在研究药物对肿瘤迁移抑制的情况下，不少文献报道是先用药物处理细胞，处理后的细胞再消化制成单细胞悬液并加入transwell上室，再温箱培养6-12小时，有的超过24小时，有的却是4小时便可，具体根据细胞类别而定。
—--
2.同样研究药物抑制方面，园子里战友经验是细胞悬液和药液一起加入小室，比如实验组是90μl细胞悬液+10μl药物，对照组是90μl细胞悬液+10μlPBS（或者无血清培养基），再温箱培养一段时间。【我是这样做的，效果不是很好】
—--
3.这是我第一次听同学说的，就是类似MTT的方法，培养中细胞先制成单细胞悬液，不加任何药物，transwell上室接种100μl，等细胞贴壁后隔天更换上室培养液，加入含有药物的无血清培养基。
—--
我认为以上3种方法的前两种方法可行性更强，第3种方法操作起来极其不方便，今天试了，特别是上室换液的时候，由于是costar的24孔板，孔小不易换液操作，移液器吸取上室培养液时，吸了100μl后下室液体便渗上来了，再洗时必然把下室培养液吸取。更何况，第3种方法也只能适合迁移时间较长的细胞。现请教园里战友和前辈们，哪种方法比较可行并易于操作？特别是第一种，自己还没有试过。

bamboo16[使用道具]
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发表于 2012-1-17 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得还是主流的第一种方法科学一点。许多药物或者干扰因素都可能对细胞的增值有促进或者抑制的作用，如果采用第二种方法，添加的药物或者别的干扰试剂必定对每个小杯里的细胞数量有影响，成为产生误差的可能之一。

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发表于 2012-1-17 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

LZ，顶你一个。
还有一种情况LZ没说的，我补充一下
4）上室和下室培养基成份基本相同，但将所要研究的细胞因子放在下室内，而不是LZ说的第二种情况（所要研究的因子和细胞都放在上室内）

bamboo16[使用道具]
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发表于 2012-1-17 16:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得还是主流的第一种方法科学一点。许多药物或者干扰因素都可能对细胞的增值有促进或者抑制的作用，如果采用第二种方法，添加的药物或者别的干扰试剂必定对每个小杯里的细胞数量有影响，成为产生误差的可能之一。

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但是第二种方法产生的误差和影响可以做细胞生长曲线来看看，如果没有差异，也就是说对于迁移到下室的细胞，不是因为药物抑制或者促进增殖而导致的细胞数减少或者增多，而是因为药物抑制或者提高了细胞的迁移能力或者侵袭能力，如果发文章，这些数据都要提供给编辑部。此外transwell迁移实验一般24小时内观察结果，往往干扰因素还没有这么快发挥作用，国外一些文献也是这么报道的。期待批评的意见

fsdd817[使用道具]
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发表于 2012-1-17 16:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我来说一下自己的看法,
我觉得选择具体哪一种方法来进行细胞培养,不是我们随意地来进行选择,而是根据我们所做实验的目的来选择采用哪一种方法,比如说,有些药物对细胞的作用一段时间以后才能达到我们实验目的所需要的模型细胞,而有则要要观察在两者培养后,进行一段时间的预处理,才能进行实验,所以才会选择第三种实验,当然也就有第二种同时进行共培养.所以我认为在决定用哪种方法要具体问题具体分析,多查文献,拿出证据,才有说服力.
本人愚见.

caihong[使用道具]
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发表于 2012-1-17 16:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

loli[使用道具]
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发表于 2012-1-17 16:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主自己做的那个不是传统的transwell实验吧，传统做法是要加入matrigel的，观察细胞的侵袭能力，中间涉及mmp等酶的释放，这样可以避免下室液体的上逸的情况
如果单纯看过膜，应该是司徒郑强书中的millicell实验
就算是millicell实验，或许应该多种些细胞，等细胞事先贴壁后再在上下室间制造细胞因子浓度差，此时换液，应该不会有太多下室液体上来吧
当然应该注意外室液体不要加太多，不然压差太大了
一点想法，望交流

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transwell只是一种工具，可以用来做细胞迁移和细胞侵袭，kejia0422战友你所说的是需要铺胶的transwell细胞侵袭实验，我现在说的是transwell细胞迁移实验，而迁移实验是不需要铺胶的，英文翻译分别是migration assay和invasive assay，似乎是这样。关于液体上渗，我试过了，在不铺胶的情况下下室液体是挺快就能向上往上室内渗的。
附注：我做的是Costar的24孔板，内有12个小室，滤膜直径6.5mm，孔径8μm，未铺胶，货号3422。

caihong[使用道具]
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发表于 2012-1-17 16:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主仔细研究一下cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7506372&sty=1&tpg=2&ppg=1&age=0#7506372')和cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7453397&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#7453397')
过几天我也做这个了，多交流

克隆鱼[使用道具]
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发表于 2012-1-17 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果是瞬时转染细胞要看其迁移能力，那么是转染24小时后消化细胞重悬后种入小室，再过几小时后观察才应该是转染24小时后的结果？还是转染不到24小时就消化重新种入小室，到24小时再观察？请赐教！

zhezhe[使用道具]
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发表于 2012-1-17 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚刚出现一种新方法，是美国Platypus的，大家可以参考一下：
cuturl('http://www.platypustech.com/discoverassemblykit.html')

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