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标题:[求助]欲做流式分析细胞周期，如何制备单细胞悬液？

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发表于 2012-1-18 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]欲做流式分析细胞周期，如何制备单细胞悬液？





欲做流式分析细胞周期，细胞太稀可能数目不够；太密单细胞悬液制备不好。以前尝试过，用力吹打后肉眼感觉可以，但是加入冰乙醇后就产生许多白色絮状沉淀！请高手指教！谢谢先！
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发表于 2012-1-18 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是培养细胞么？还是急性分离的外周血细胞
培养细胞一般选择在对数生长期的细胞，用胰酶（0.25%~0.05%,视细胞贴壁牢固程度）消化，再吹打下来，离心，重新悬浮
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黄花菜[使用道具]
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发表于 2012-1-18 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

悬浮或贴壁细胞酶解处理成悬浮细胞后，离心收取1-2X10^6细胞，PBS洗一次，留100-200ul PBS, 涡旋混合器重新悬浮细胞沉淀，边混合边逐滴加入5ml 70%-20C的乙醇.
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发表于 2012-1-18 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加入-20度的乙醇吗
书上说加入冰乙醇，不知道是什么概念，要是乙醇放在-20度的话不就冻住了吗？
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2012-1-18 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

乙醇好像不结冰的。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-1-18 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也碰到同样的问题，加入冰乙醇后就产生许多白色絮状沉淀，能继续做下去吗？
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-1-18 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

絮状沉淀应该是细胞团，细胞分散后不会再有这种现象．不过好象不影响做流式，你可以问问做流式的老师．
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junhun[使用道具]
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发表于 2012-1-18 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加入冰乙醇后要充分混匀，就可得到单细胞４℃固定至少２４小时，做之前再离心，PBS洗两次，加PI避光染色３０分钟（根据细胞数量决定加的量，只要多做几次，同一批标本加等量，一般都可以的），就可以了检测了，相信自己，你一定会成功的！
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发表于 2012-1-18 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近也在做流式，检测凋亡的，已经试验了好几次都不成功，很是苦恼。有些问题也想请教以上几位学者：细胞状态不好是不是也影响流式？另外，有时候担心细胞数量不够，就等细胞长的很满才做，这样消化制备细胞悬液时就很麻烦，老是有细胞团。该怎样处理呢？还有一个问题：作流式必须用70％的冰乙醇固定吗？它主要起什么作用？我以前作的时候都没有这一步。若是细胞悬液制备好了，不能及时做流式，需要等一两天，可不可以先把细胞悬液固定，怎么固定法?最多可固定多长时间？谢谢大家给予意见！
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发表于 2012-1-18 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我来回答吧：1。细胞本身的状态肯定会影响流式的结果。2。细胞数量：我用5乘10的4次方的细胞100ml接种到培养瓶，72小时后细胞量足够，如果加了干预因素，那么可以把加干预因素的细胞做两瓶或是三瓶。3。细胞团出现的可能性一个是细胞密度太大，一个是消化时间不够。4。作流式必须用70％的冰乙醇固定，具体作用我一时也说不清楚，但是是将细胞的分裂或其他活动终止了！及固定后的细胞活动（例如有丝分裂）处于静止状态，这是间接终止干预因素继续作用的一种方法吧！5。细胞悬液制备好了，可以在4度冰箱里存放半年之久，完全不用担心。6。固定时间：加了-20度预冷的70％的冰乙醇后就直接放在4度冰箱里。
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