色谱爱好者之家

　卫生部近日汇总公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单》，上海月旭公司从公布的黑名单中统计发现，包括三聚氰胺、苏丹红、孔雀石绿、人工合成色素等都在内。针对这些令人触目惊心的食品添加剂，同时也为食品安全检查和监管工作提供有力的技术支持和保障，上海月旭公司迅速组织相关人员研制出了方便、快速、准确的检测方法，现将LC-MS/MS检测水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿的方法公布如下：


1. 适用范围
适用于水产品（鱼、蟹、虾、甲鱼等）中孔雀石绿和隐形孔雀石绿的检测。


2. 提取
称取相当于原始样品5 g样品(精确至0.01g)制备好的试样，置于50mL塑料具塞离心管中，加入10µL 1μg/mL的混合内标标准溶液，依次加入1 mL 0.25 g/mL盐酸羟胺溶液、2 mL 1.0 mol/mL对甲苯磺酸溶液、2 mL 0.1 mol/L pH=4.5乙酸铵缓冲溶液，摇匀后，加入30mL乙腈，剧烈振摇2min,离心5 min(4000r/min)。将上清液转移到250mL分液漏斗中，用30mL乙腈重复提取残渣一次,合并上清液。于分液漏斗中加入50mL二氯甲烷,30 mL水，振摇2分钟,静置分层，收集下层有机层于250mL旋蒸瓶中。45 ℃旋转蒸发近干。
在旋蒸残渣中加入5mL 乙腈，漩涡振荡器，溶解残渣，待净化。


3. 净化
活化/平衡：将Welchrom® PRS 500mg/3mL (P/N：WSS46PR0305)安装在固相萃取装置上，上端连接Welchrom® Alumina-N 1g/6mL（P/N：WSAN010610），用5 mL乙腈活化小柱，流出液弃去；
上样：将上述待净化液加入柱中，流出液弃去；
淋洗：用5 mL乙腈淋洗小柱后，弃去中性 Welchrom® Alumina-N小柱，然后将PRS抽干；
洗脱：5 mL乙酸乙酯：甲醇：氨水（50:45:5）混合溶液洗脱，收集洗脱液
40℃氮气吹干，1 mL流动相溶解，0.22μm针孔滤膜过滤后，待分析；


4. 色谱质谱条件
4.1 色谱条件
色谱柱： Xtimate C18 液相色谱柱（2.1mm*50 mm, 3 μm）
流动相：
A: 0.1%甲酸+2 mM乙酸铵水溶液
B：乙腈
梯度洗脱
流速： 0.4 mL/min
进样量： 10 μL
柱温： 40°C
运行时间：12 min
4.2 质谱条件
扫描模式：MRM
离子源：ESI+
毛细管电离电压：3000v
干燥气温度：350 ℃
干燥气流速：11 L/min
雾化器压力：50 psi


名称

母离子

子离子

碎裂电压（Fragment）



驻留时间


（ms）

碰撞能量


（V）

定量离


子对

定性离


子对


孔雀石绿（MG）

329.2

313.1

140

30

40

+

-


208.1

140

30

38

-

+


隐性孔雀石绿(LMG)

331.2

316.1

140

30

20

+

-


239.1

140

30

36

-

+


MG-D5

334.2

334.2

140

30

318.2

-

-


LMG-D6

337.3

337.2

140

30

322.2

-

-



5. 结果
5.1 回收率和重现性实验
将猪肌肉空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，添加浓度分别为0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/ kg、每批次内同一浓度做3次平行实验，共3个批次（样品典型回收率色谱图见附图）。


添加水平（μg/kg）



分析物
0.5

2

10


Recovery (%)
RSD (%)
Recovery (%)
RSD (%)
Recovery (%)
RSD (%)

孔雀石绿
110.8

7.53

98.1

6.56

96.1

4.71


隐性孔雀石绿
95.3

7.43

103.5

3.42

97.4

4.55





图1 鳕鱼中添加0.1 mg/kg 盐酸克伦特罗EIC谱图 图2 鳕鱼中添加0.1 mg/kg 莱克多巴胺EIC谱图


本方法中使用到得耗材：
1． 固相萃取小柱 Welchrom® PRS 500mg/3mL (P/N: WSS46PR0305);Welchrom® Alumina-N 1g/6mL（P/N：WSAN010610）
2． 色谱柱：Xtimate C18, 2.1*50 mm，3μm（P/N:Xt3B18205）
3． 13mm，孔径0.22μm尼龙针孔滤膜（P/N: WEL-SFNY213022）
4． 12孔固相萃取装置（WEL-Vac-12）