细胞世界

就我个人的观点而言，在你写的实验步骤中反映你可能最重要的原因在于细胞消化过度，建议缩短消化时间（8-10min试试，放培养箱孵育，中间时摇动一次）；另外减少吹打次数和轻柔吹打混匀细胞也是一个提高细胞活力的重要因素，有条件可以用胰酶+2型胶原酶混合消化，也可减少细胞损伤。

我知道的问题回答如下：

1. 心外膜在取心脏时就已破裂了，所以取的是心脏组织，我没有去外膜，心脏组织可以剪取靠心尖2/3左右。

2. 消化液减少到5mL试试，时间缩短为8Min试试看，消化下来到细胞冰浴，总次数在不超过15次为佳，剩下的组织轻轻吹打都会散开成细胞了。在一次消化结束时，不要吹打，直接吸取上清，絮状物质一般沉淀在底部，不易吸到。

3.网筛残留的成份多为DNA等絮状物质，可以用一些培养基洗几次，剩下的就不要了，其实细胞残留在上面的并不是很多。

4.细胞悬液洗涤不知道是什么意思，其实离心去上清再混匀就可以了，我都没有洗涤的

5.差速贴壁没有细胞，那是细胞消化过度，正常的话，1.5 h 成纤维细胞都长出伪足了。

耐心一些，原代培养可能更多的和个人操作关联更大，仔细想想，感悟一下，多做几次，细胞会长好的，祝成功！

曾经我也迷茫过，失落过很长时间，最后细胞都跳起来了，120次/min, 幅度0.1 。

感谢你热心的回复，最近由于细胞养不好，内心十分的煎熬，我也查了不少的资料，不同的人有不同的做法，但是也都可以培养成功，看来如你所说，还是得靠自己慢慢的摸索，找到适合自己的方法。我会好好分析原因，准备明天参考你的意见再做一次，希望细胞真的能够长好！我还有些疑问，希望你能再次指导下，真的很感谢你无私的帮助！！！

1 我刚才看了你几个月前的一个帖子，上面有你的实验记录，发现你是在离心重悬之后过滤的，但好多人是先过滤后离心重悬的，你认为这两种做法有没有大的区别呢？

2 胰酶我是用PBS配制的，但是很多人用的D-Hanks液，你认为这会对胰酶的消化有影响么？

3 多次收集的上清是最后一起离心好呢 还是先分出来的先离心重悬？你都是用多少量的含10%FBS的培养液来中和胰酶的作用的呢？我都是把分次得到的上清放到一块儿用含血清的培养液中和，不知这样做可不可以？

4 最后的差速贴壁时你把所有细胞悬液种在一个培养瓶里面么？还是根据消化乳鼠的数量来决定种的培养瓶数量？我一般做10到15只Balb/c乳鼠

又有这么多问题，都是一些细节的东西，还望你能不吝赐教！再次感谢！

1 谢谢你的回复，我之前就遇到你说的情况，离心后絮状物悬在上清中，所以才用了200目筛网，但是又出现了液体滤不下来的问题，不知道是我没有消化完全还是消化过度了，觉得分离出来的上清都是黏黏的，不知道你有没有遇到过这样的问题？

2 “我是直接把每次消化后的放到4ml胎牛血清中、置于冰上，都没有问题。”你是把几次消化后所得上清全部放一块儿的么？放在纯的胎牛血清？

我刚看了你之前的帖子，好羡慕你能把细胞养的那么好！希望你能多指导下我，我们这边就我一个人做心肌细胞的原代培养，都没有人可以请教，只能靠园子里的老师和战友来指导了，我已经改进了几次了，可还是没有养好，真的很迷茫~

1.液体倒在筛网上是会产生张力的，你可以用无血清的培养基冲一冲，或是用枪头戳一戳，破坏这种张力，就会流下去了。刚开始我也碰到这种情况。

2.我是把几次消化后的上清全部放到一管已装好的纯血清中，这样中和效果岂不是更好？（自己理解的，呵呵）

我也是自己一个人摸索过来的，刚开始跳楼的心都有。现在也一直在养，不过我现在用得是胶原酶，不管细胞数量和活力都较好。如果楼主想省时间，不防一试。

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你真是个热心人，懂得思考，勇于创新！我还是第一次看到有人加纯的血清中和胰酶呢，很多东西的确是需要自己勤于思考，不断的摸索才行啊！真是受教啦！我如果是版主，一定给你加分

1 我正有打算加上胶原酶呢，希望能得到好的结果。

2 我看到你有帖子记下了你的实验步骤，但当时你好像也还没有养好呢，不知又做了哪些改进才培养成功的呢，冒昧的打听下你的实验步骤，比如酶的浓度和消化时间等问题，还望你不吝赐教

这是你曾经的步骤，俺给你拿过来了

“我分离乳鼠心肌的步骤如下：
1.10只1-3天内乳大鼠，无菌下剪取心室前部分，PBS冲洗
2.剪碎心肌组织，移入50ml离心管，封口膜封口，37度水浴锅中摇晃消化
3.第一次消化：0.1%的胰酶6ml消化10分钟，弃掉上清
第二次消化：0.1%的胰酶+0.05%的Ⅱ型胶原酶各3ml,消化10分钟
第三、四次消化：0.1%的胰酶+0.05%的Ⅱ型胶原酶各1.5ml，消化6分钟
4.总共消化四次，组织块消失。收集的上清用等体积含10%的胎牛血清中和，1000转、离心10min,PBS洗一次，离心重悬细胞。
5.接种到两个10cm皿，差速贴壁1.5小时后可见皿底一层细胞。悬液接种到两块24孔培养板，密度约为1*10^5/孔”

你现在还是这样做的么?

真的非常非常感谢你无私的指导和帮助！

1.迅速取出心脏，挤出心脏内残血，剪碎心脏，放入50ml离心管中。

2.移入0.06%的胰酶5ml，吹散组织碎块，恒温振荡器（实验室刚买的，就不用手摇了，呵呵）中消化约10分钟，弃掉上清。

3.移入0.08%的胶原酶5ml,吹散，振荡消化10-15min,上清移入血清中，重复三到四次。中间每5 min可以取出来吹散组织(因为振荡时组织聚集成一团，吹散开对消化完全非常关键）

4.过滤，离心，重悬，接种差速贴壁1.5小时，铺板。48小时换液，就可以看到成片贴壁搏动的细胞了。

到差速前整个过程2小时左右，尽量减少操作时间，注意无菌操作，祝你早日成功。

现你的问题回答如下：

1. 我以前是过滤后离心的，按照现在实验室的protocol是离心后重悬细胞，再过滤，个人觉得区别不是很大，这不是最重要的影响因素，所以不必太担心。

2. 胰酶重要的是不能和钙离子混合消化，所以不管是PBS还是D'hanks，都是无钙镁离子的。大家偏好用D'hanks的原因是因为D'hanks含有很多的营养成份如葡萄糖等，所以可以在消化时，给细胞提供一些营养，从而增加细胞的活力和活率。

3. 每次消化的上清都必须立即进行中和，中和后若不离心，则必须保持低温，如冰浴或放4度等，最后一起离心。

4. 细胞密度也是影响心肌细胞跳动的重要因素，心肌细胞几大关键特点就是传导性和同步性，传导性是指细胞可以相互传导电信号，只有细胞相互联系，才能同步跳动，细胞密度过大或过小都很难同步跳起来。而密度选择和个人的计数也存在关联，建议可以选择不同浓度梯度，先在96板上试试合适的密度，然后换算平皿试试。我在96孔板时，细胞密度约为20K/Well细胞跳动最好，而有的人可能15K或10K都是可以的，这和个人的计数方式有关的。正常情况下，一次8只SD大鼠乳鼠，大约可以铺一块96孔板是足够的。