小中大注意事项：1. 复苏后首次分皿时经消化后尽量用tip头柔和吹打15次，使成单细胞。2. 包被非常重要。PLL要质量好，不要多次回收使用，一般使用两次就丢弃。包被过夜后要彻底用灭菌ddH2O 洗3遍。3. 实验尽量使用同一批号的试剂，以免细胞的表型发生变化影响实验结果。4. 7.5％co2 是最好的。你可以试试。当然5％也可以，但是长得慢
5. 用trypsin后PC12会不健康，所以有二个办法。(1)每次用完trypsin后1000rpm离心3min。将trypsin吸走。(2)每次subcuture时候不用trypsin,和PBS，直接用medium把贴壁的细胞吹下来吹成单个的再长。6. PC12细胞的生长密度在70-80%时，就可以传代了，如果等长到很密的时候，好多细胞会出现分化的状态，不是很适宜做下一步的实验呢。再有如果你的细胞是分散的密集，是不是传代时的密度不够呢，可以试一下1:2传代。7.分化后PC12细胞生长一段时间后贴壁能力有些会减弱，尤其板中间生长密集处或者培养时间稍长。此时，若用刚从冰箱中取出的PBS冲洗，很可能造成细胞脱落。PBS冲洗时一定不能用枪向孔中央直接大力吹打，很容易造成细胞被吹掉。结合以往经验，建议：（1）PBS自冰箱取出后置室温20～30min，然后使用。（2）用滴管或枪头研孔壁慢慢加入PBS。（3）也可以尝试用预热无血清培养基进行冲洗。8. 复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞，去除了冻存液中的DMSO，如果没有去除DMSO，细胞培养过夜后就要彻底换液；如果复苏时洗涤离心过，可以待传代时再换液也可。（据我个人经验，还是复苏时去除DMSO，细胞的生长状态好一些）
9. 状态良好的细胞复苏后4 h即可贴壁，开始增殖48h应该到了对数增长期，即可传代。
10. 每天观察一两次细胞我不认为会对细胞的生长造成不良影响，不过每次观察的时间不易过长。
11. 传代时我认为最好不要用胰蛋白酶，因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。我以前用胰蛋白酶消化传代过PC12, 结果传代后的细胞虽然贴壁，形态也好，但就是增殖缓慢，所以我现在都是用枪吸取培养液直接吹打，传代后细胞增殖迅速，2 d就长满了（因为长的太快，我只好降低血清浓度，用5%FBS）
12. 传代的时机最好选在细胞生长旺盛，占瓶底70%－80%时最好，如果细胞长的太满，细胞的状态会越来越差，最后大片死亡；这种细胞传代后生长也不好；而且长的太满后，细胞贴壁牢，难于吹起来，相反，70%－80%时细胞很容易吹起来。
13. 如果细胞贴壁太紧，不得不用胰蛋白酶消化，注意低浓度，段时间，多洗涤。我一般用0.025％的胰蛋白酶，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，或用肉眼观察，瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止，中止一定要彻底，要用含血清的培养液多洗涤离心几次，确保去除剩余的胰蛋白酶，否则传代后的细胞难以生长。
14. 就培养器皿的选用，我推荐在60mm的培养皿中培养传代，第一，在皿里细胞生长的更快，我想可能是皿比瓶的气体交换更好吧；第二，传代时吹打更方便，不易污染。去除胰蛋白酶时最好用含血清的培养液在4℃下离心，血清不仅可以中止胰蛋白酶的作用，对细胞也有保护作用，一般用800～1000rpm转10min即可，最好离心洗涤3次。传代后不长有可能与胰蛋白酶有关。15. 未分化的PC12是很难养的，要注意包被培养瓶。你的培养基最好换换，可以多查文献啊，一般是高糖的DMEM+5％FBS+10%马血清（我的经验是Gibco的马血清贴壁最好）；马血清的功能是抑制PC12细胞形态的变化，有利于贴壁生长，不会抑制你用NGF诱导的PC12分化的；胎牛血清的作用是与细胞的增殖有关。PC12换液不要太勤！3到4天换液都行，并且最好保留一部分（如三分之一）旧培养基，有利于细胞的贴壁与增殖！！有人说传代时用胰酶消化用0.025％的胰酶消化30秒就足够了，你可以试试，我没有用胰酶也行，为了让细胞不起团，我用了0.02％的EDTA帮助吹散细胞，但是也有点麻烦就是要离心一次。总之，养好PC12的关键在于马血清的选择（Gibco的最好）以及传代过程中对细胞的处理（吹打太多会影响细胞的贴壁，反之PC12会成团).还有PC12是不怎么贴壁，我们做MTT时要让它们贴壁都是用多聚赖氨酸进行包被。多聚赖氨酸分子量300000，储存浓度1mg/ml(用PBS液配制)。4度保存。用时稀释到50微克/毫升，加到包被的容器里，37度孵育过夜（我们一般都晚上做的），早上回收多聚赖氨酸，照紫外4小时后，再铺板。这样细胞贴壁效果较好。多聚赖氨酸一般用3～4次，就不要了！
16. 蒸馏水溶解聚L-赖氨酸（10mg/l），过滤除菌，培养瓶内加入溶液，覆盖底壁即可；静置15分钟；去除溶液；加入培养液覆盖底壁，孵育2h，即可接种细胞！按照您的配方，您用的浓度应该是0.01mg/ml，比我刚才看的Midas主任推荐的0.02mg/ml还要低，我们实验室用的浓度是0.1mg/ml．而且我们使用时一般是要包被过夜的，我曾经着急用，就包被了两个小时，好像一点作用都没有．请问一下您用的是Poly-l-lysine还是Poly-D-lysine，我们用的是Poly-D-lysine. 是Poly-l-lysine可以适当提高浓度
