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标题:[讨论帖]细胞划痕实验

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[讨论帖]细胞划痕实验




很多群友肯定现在都做过关于细胞迁移的实验。
其中划痕法以其材料廉价,操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。

我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。

材料:
6 孔板(其他的也可以,但感觉6孔比较好,大小适中)
marker笔
直尺
20微升枪头(灭菌)
无血清培养基
PBS

准备:
所有能灭菌的器械都要灭菌,直尺和marker笔在操作前紫外照射30min(超净台内)

流程:
1。先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀得划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2。在空中加入约5X105个细胞,具体数量因细胞不同而不同,掌握为过夜能铺满。
3。第二天用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜。
4。用PBS洗细胞3次,去处划下的细胞,加入无血清培养基。
5。放入37度5%co2培养箱,培养。按0,6,12,24小时取样,拍照。

下面是照片,细胞NIH3T3
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6h NIH3T3


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24h NIH3T3


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misswu61[使用道具]
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楼主的照片很漂亮但是用六孔板我觉得有些浪费,我们实验室常用的是96孔板,可以同时做很多平行复孔。不知你照片拍完了之后用什么软件统计划痕的宽度呢,我们一般使用共聚焦显微镜自带的软件。你能把统计方法介绍一下吗?
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老实说,我们实验室没有什么好的软件。所以一般只作定性,不作定量。
如果楼上有好的软件能否共享一下,不胜感谢。
6空板可以保证有相当距离的平直划痕,我觉得挺不错的。而且因为有5条定位线,与划痕相交,这样就有10个可固定监测点,不作重复,误差也很小。
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hyuu[使用道具]
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谢谢楼主,照片很漂亮,实验步骤也很清楚。

需要提醒楼主的是:如果你连续监测24小时,你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果,而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移,你可以先用丝裂霉素处理一小时,抑制细胞的分裂,这样你的结果就是细胞迁移的作用了。

照片拍完之后,可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。
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一叶[使用道具]
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回复 #7 hyuu 的帖子

谢谢。无血清的话,应该一个细胞周期内,增殖可以忽略吧。而且我定点监测的话,差不多可以对应到每个细胞。好像没有看见很明显的增殖现象。丝裂霉素貌似很贵的说。。。如果用这个还不如直接用transwell呢。
另,image J 哪里有下载么?谢谢。
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ImageJ 下载网址:cuturl('http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html')

无血清培养,确实细胞增殖可以忽略了,不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节,细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢?你这不是“又叫马儿跑,又叫马儿不吃草么“。呵呵
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kulee[使用道具]
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谢谢,群友的提醒,确实存在这个问题。所以目前最好的方法还是transwell法。
一般做划痕实验,都是无血清或者低血清(《2%)否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时,但对于一些特殊的细胞系来说,生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养,短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。
划痕法的意义在于,价格低廉,操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯,容易控制。(比如做加药的,可能会和血清的组分有反映,而且受血清批次的影响,造成误差。如果是铺了ECM物质的,组分就更复杂了。)
划痕法的不足也很明显,适用的细胞系很窄,一般只能用于上皮,纤维样细胞系。因为
1。这些细胞本身有迁移能力,且较强。
2。细胞有极性,方便测量,观察。
3。细胞对无血清有较强的忍受力(至少24小时),因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的,很多肿瘤细胞系在无血清培养下,12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。

另:在此贴出的图片都是本人实验数据,非将本人同意不得转载,引用。如需要引用者,请同本人联系协商。

一下是一种上皮样细胞的48小时监测图。可以看到划痕已近弥合。


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