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标题:[求助]大鼠外周血中性粒细胞分离

wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-2-3 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]大鼠外周血中性粒细胞分离




因为实验需要分离中性粒细胞体外进行凋亡率的检查,我采用的是Ficoll-Hypaque密度梯度及红细胞裂解法,实验技术本身似乎并不复杂,但是做了几次效果都不太理想,细胞分离后在显微镜下观察每次都有密密麻麻的类似杆状的东西,非常小,这些杆状的东西有一点点轻微的活动。有师兄说可能是细菌，但即使在采血过程中被污染了，也不可能才分离出的细胞就被密密麻麻的细菌包围着吧？

另外分离出来的中性粒细胞纯度和活性都需要95％以上，我发现我分离出来的细胞即时在400倍下也非常小，很难确定分离出来的细胞就是我需要的中性粒细胞。请问这里有哪位前辈做过这个方面的实验，给一些指点和帮助，不甚感激！！！！

以下图片是我把分离的细胞做了涂片行HE染色的照片，原先密密麻麻杆状的东西染色后就是背景那些红点点。细胞染色后是紫色的，我在油镜1000倍下还是看不清楚细胞核，无法显示教科书上中性粒细胞的分叶核，所以做了几次后我还是不确定我分离出来的细胞是否就是中性粒细胞 。


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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-2-3 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是另外张细胞涂片，还是差不多的 。


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发表于 2012-2-3 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人愚见：
从血中分离中性粒细胞，除器皿消毒外，采血方式和技术很关键。如果采血技术过硬，建议使用心脏穿刺采血（学药理的都会），实在不行，只能在超净台中从腹主动脉采血。映象中Ficoll-Hypaque密度梯度（密度好像是1.17还是1.77？记不清了，文献应该有）好像可以直接分离得到中性粒细胞，没必要采用红细胞裂解法。此外，可以通过腹腔注射酪蛋白，收集腹水，再通过密度梯度离心手段分离，也可以得到中性粒细胞（活力在96%以上），国外文献也有报道，操作也很简单。多看看文献，比较所用的方法，找到合适自己的方法。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-2-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢你的建议

我也是采用心脏穿刺采血，不过每只大鼠最多也只采到6ml，也有的时候只采到2ml，应该技术还不过关吧。

我采用的也是Ficoll-Hypaque密度梯度法，比重是1。077，因为大鼠红细胞比重是1。090，中性粒细胞的比重是1。091，所以离心后红细胞和中性粒细胞都位于分离液下方，两种细胞做不到分层，所以红细胞裂解肯定还是需要的吧。

听说有专门的中性粒细胞分离液，比重是1。091的，我不确定这样是否更容易分离，因为价格比1。077要贵很多，不知道有哪位前辈用过，给一些建议吧，谢谢了！
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吴才子[使用道具]
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发表于 2012-2-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉染色的是淋巴细胞
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发表于 2012-2-3 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我这一段也在试图分离大鼠外周血中的中性粒细胞. 我们这里有人用淋巴细胞液,和人用的多形核细胞分离液, 我试图用人用的多形核细胞分离液来分离鼠的中性粒细胞. 但发现中性粒细胞与单核细胞, 淋巴细胞基本混在了一白色的溥层中. May-Grunwald-Giemsa 染色后似乎觉得中性粒细胞在白色层的稍下层,但没有明显界线, 大量的是如楼主所染的淋巴细胞样的细胞. 总的来讲不理想. 曾试图用不同的离心速度, 但改变似乎只是白色带的宽度. (由于染色效果不理想,所以只能用似乎这两字,见凉). 我用的这种分离液的密度是1.113 g/ml. 所以有个问题是: 既然如楼主所说红细胞的密度是1.090, 何以我离心后红细胞仍然被离心到了最下层.

楼主所用的分离步骤可否告知, 不胜感激!!
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caihong[使用道具]
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发表于 2012-2-3 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不可以用人用的多形核细胞分离液来分离鼠的中性粒细胞，虽然两者的密度一样，但是鼠和人细胞所带的电荷是不同，所以会影响分离出来的效果。

我开始买的是人用的密度1.077的淋巴细胞分离液，来分离大鼠的中性粒细胞，结果浪费了很多时间，分离出来都是我上面涂片那样，基本上都是淋巴细胞。后来我改变了试验方案，转做人的中性粒细胞，用原来的分离液就分离出中性粒细胞了，而且量很多，纯度也很高。因为人的中性粒细胞的比重是1.090左右，这样中性粒细胞和红细胞是分不开的，需要用红细胞裂解液。

分离中性粒细胞，我觉得需要注意的就几点：一是刚才我说过分离液密度的选择。二是离心机的应用，必须用水平离心机，那些角转子的离心机不可能有好的分离效果。三是操作技巧，尤其是白细胞悬液加到分离液上层的时候，应注意不可以破坏分离液和白细胞悬液之间的界面。可以用吸管在液面上1cm沿管壁缓慢下流。

基本上我觉得关键的技巧就这些，GOOD LUCK！
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okhaha[使用道具]
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发表于 2012-2-3 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我终于分到比较纯的中性粒细胞了.


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nn255[使用道具]
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发表于 2012-2-3 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好 我也在分离牛外周血的中性粒细胞 用的是天津的试剂盒（天津灏洋），但是分离不出来很好的效果 只有百分之六七十，含有淋巴细胞，各位学哥 学姐们有什么好的建议 可以方便联系一下吗？
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