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标题:[求助]培养基中谷氨酰胺的问题?

ritou1985[使用道具]
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1
 

[求助]培养基中谷氨酰胺的问题?



在学习细胞培养的基础知识时候注意到下面一段话:
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谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4℃下放置7天即可分解约50%,所以都是在使用前添加

配制好的培养液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,以便临时加入培养液内

使用终浓度为1-4mmol/L

一般配制为100倍浓缩液,即浓度为200mmol/L(29.22g/L),配制方法为 :
谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后(应加温30℃),过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液,终浓度为1-4mmol/L

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想问问大家的谷氨酰胺的问题是怎么样解决的? 因为我的培养基已经配制了1个月了。可是我才用了一点。
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ritou1985[使用道具]
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2
 
在 司徒镇南 的书上也写的有,问了师兄师姐对这个问题不是很在意。
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一叶[使用道具]
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3
 

帮顶一下,一般刚配好的DMEM培养基在2周内不用加谷氨酰胺,然后每隔两周补加一次谷氨酰胺。
附上我们关于配制并分装100×谷氨酰胺溶液50ml的方法:
1、称取谷氨酰胺1.4600g,加50ml三蒸水,摇动,搅拌溶解使固体充分溶解(约需10-20分钟)
2、吸入干净,干燥的50ml注射器中(挑选注射器时要注意针筒和活塞的匹配,不然太紧,吸入和吹出液体都很费劲,会增加很多麻烦),转入无菌间
3、于超净台内,打开一无菌的100ml血清瓶,无菌操作,取出一滤头,插在注射器张(配制谷氨酰胺专用,不得挪作他用),缓缓将滤过的液体注入血清瓶(约需5-10分钟)
4、取1ml吸管,将谷氨酰胺分装入无菌试管(或1.5ml的EP管)中(每管1ml,可一次全部分装完毕(50管),拿出超净台,封口膜封口,
5、将分装好的谷氨酰胺放入-20度冰箱保存,注意不要将试管或EP管放倒,不要让液体浸到袋子上,最好让其直立,等溶液完全冻结后,再放倒保存。
6、临用前,提前30分钟-1小时将一管(1ml)谷氨酰胺从冰箱取出放于室温化冻,(或者提前1-3小时充-20度取出,放于4度冰箱化冻),待谷氨酰胺全部融化后转入超净台,无菌操作,加入到培养基中,做好标签。
7、配制时不要试图配制更大浓度的谷氨酰胺贮存液,因为此时溶解会有困难。
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ritou1985[使用道具]
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回复 #3 一叶 的帖子

有点不明白之处:“ 5、将分装好的谷氨酰胺放入-20度冰箱保存,注意不要将试管或EP管放倒,不要让液体浸到袋子上,最好让其直立,等溶液完全冻结后,再放倒保存。”为什么最好要放到呢?不可以一直处于直立状态么?
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一叶[使用道具]
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5
 

呵呵,刚发现有个笔误,是不要让液体浸到盖子上。可以一直处于直立状态,我们那的冰箱容积有限,所以完全冻好后就可以放到了,只是为的是少站容积留出空间而已。
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woshituzhu[使用道具]
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请问如果没有定期加入谷氨酰胺,细胞会出现什么症状 ,生长缓慢?抑或。。。因为刚开始养细胞三个礼拜而已,还没有在完全培养基里另外添加过谷氨酰胺,谢谢哈
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tuuu2[使用道具]
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我曾经有段时间没有注意到谷氨酰胺的重要性,培养基加了谷氨酰胺后在4度冰箱放置了较长时间。结果细胞复苏后总是长得不好,细胞长得很慢,血清浓度加到10%依然如此,且细胞状态非常不好,细胞里面总是有很多黑色颗粒和空泡。
以为是细胞复苏的问题,后面又重新复苏了细胞,还是如此。最后配了新的培养基,加了新的谷氨酰胺,PH值调低了一些。换液后仅一天的时间,细胞状态随即好转,慢慢的细胞长得越来越好。现在细胞不仅状态好,而且长得快。
所以说谷氨酰胺真的很重要,配好之后,分装一定要小量分装,最好是够一次培养基的量即可。都放在-20度冻起来,要用了,就取一支。培养基也最好一次少配点,放久了PH值会变碱,影响细胞生长。
我们的培养基都是自己配的,买的粉末。PH值可自行调节,当细胞状态不好的时候就调酸点,细胞状态好的时候可以稍偏碱一点。
都是经验之谈。
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我们的培养基都是自己配的,买的粉末。PH值可自行调节,当细胞状态不好的时候就调酸点,细胞状态好的时候可以稍偏碱一点。
都是经验之谈。

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请问你的 ph值具体是怎样调节的?是HCL和NAOH吗?
培养基已经过滤除菌了,是不是配好的HCL和NAOH得过滤除菌呀?
可是看有的资料上说cl离子对培养基不好?
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我曾经有段时间没有注意到谷氨酰胺的重要性,培养基加了谷氨酰胺后在4度冰箱放置了较长时间。结果细胞复苏后总是长得不好,细胞长得很慢,血清浓度加到10%依然如此,且细胞状态非常不好,细胞里面总是有很多黑色颗粒和空泡。
以为是细胞复苏的问题,后面又重新复苏了细胞,还是如此。最后配了新的培养基,加了新的谷氨酰胺,PH值调低了一些。换液后仅一天的时间,细胞状态随即好转,慢慢的细胞长得越来越好。现在细胞不仅状态好,而且长得快。
所以说谷氨酰胺真的很重要,配好之后,分装一定要小量分装,最好是够一次培养基的量即可。都放在-20度冻起来,要用了,就取一支。培养基也最好一次少配点,放久了PH值会变碱,影响细胞生长。"
我也有相同的经历,复苏总是长不起来,明明复苏后是发亮的却最后慢慢死掉.还有次取的活体瘤研了装瓶养,开始长的快,后来越来越慢,形态也不好看了.确实是没有重视谷氨酰胺,现在我都是用时拿一支添加即用,不多配制.感觉细胞没污染的情况下细胞长不好应该先考虑营养方面.
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tuuu2[使用道具]
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请问你的 ph值具体是怎样调节的?是HCL和NAOH吗?
培养基已经过滤除菌了,是不是配好的HCL和NAOH得过滤除菌呀?
可是看有的资料上说cl离子对培养基不好?

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我的培养基是用碳酸氢钠调的PH值,配好的碳酸氢钠过滤除菌。
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