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标题:[求助]请教细胞线粒体分离方法．

pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-2-7 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教细胞线粒体分离方法．




我想做的实验是观察培养细胞被某种药物作用后，细胞线粒体内细胞色素C向细胞质的释放情况．因此，需要在药物作用一段时间后，收集细胞，分离线粒体和细胞质两部分，分别进行Western，对各自细胞色素C含量进行检测．可是一直没有找到分离线粒体和细胞质的方法及步骤，有哪位老师明白，最好是曾经做过的，教一下．谢谢
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发表于 2012-2-7 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1625415&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1625415')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=648137&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#648137')
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发表于 2012-2-7 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您提供的帖子里的方法分离了线粒体，可线粒体的完整性没有被破坏。
对于western来说，我要分析线粒体里面的蛋白，是不是要把线粒体破碎才可以呀？直接用帖子里的方法提取的完好线粒体能直接做western检测线粒体里面的蛋白么？
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is2011[使用道具]
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发表于 2012-2-7 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说清楚了就好了，这方面的实验我也没有做过，呵呵！还好旁边一个同学做过。
那首先您得分离线粒体(这步很重要的  )，也可以咨询一下这个公司。
cuturl('http://www.perbio.com.cn/PIERCE/Molecular%20Biology/mis%20islo.htm')
再用细胞裂解液或者超声破碎线粒体。
cuturl('http://www.cella.cn/book/07/01.htm')
前面帖子的方法来自冷泉港的《细胞实验指南》上册，您可以找本书参考一下。
文献两篇参考一下吧。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-2-7 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
因为我的实验要分离并得到同一瓶细胞的线粒体蛋白质和胞浆蛋白，两者都得收集，以比较两者内某种蛋白的差别。在国内一篇文献我找到了简单的方法，可是真的不知道他介绍的方法对不对，他这样做真的很简单喔，还是中华牌的杂志啊。
文章剪辑部分如下：
免疫蛋白印迹检测细胞色素Ｃ:细胞培养于Ｐ100培养皿,浓度1.5×106/皿。不同时相点用ＰＢＳ冲洗培养皿2次,将细胞从皿中刮出置匀浆管中,800×ｇ离心10ｍｉｎ,小心移去上清液。加入0 5ｍｌ细胞裂解液(20ｍｍｏｌ/ＬＨＥＰＥＳ,ＰＨ7.5;10ｍｍｏｌ/ＬＫＣｌ;1.5ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ2;1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ;1ｍｍｏｌ/ＬＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ;1ｍｍｏｌ/ＬＰＭＳＦ)冰浴3ｍｉｎ;转速为2000ｒ/ｍｉｎ匀浆3ｍｉｎ;将裂解液移至ＥＰ管中750×ｇ4℃离心25ｍｉｎ,上清液为细胞浆成分,沉积物为线粒体成分,溶解于50ｍｌ细胞裂解液中。
然后作者就对细胞浆成分和线粒体成分进行western了，呵呵。
我不会在网上发caj.的全文，否则就整个发上来了。有作过的站友么？帮一下。谢了。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-2-7 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
他这样做可以分离细胞浆和线粒体么？
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发表于 2012-2-7 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是这篇吧？《线粒体细胞色素C释放在H_2O_2诱导内皮细胞凋亡中的作用》。不可行的，找个高手回答你，一会就来了！呵呵！
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发表于 2012-2-7 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实分离线粒体没有你想象中的那么难，主要还是通过差速离心来实现
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发表于 2012-2-7 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
使用dounce上下数十次。次数视细胞种类而定，最好十次取匀浆若干做台盼蓝染色，细胞蓝染在50-70%即可，进行差速离心分离，按上面的推荐。注意：次数太少细胞不会破裂，太多线立体也会破裂。力道和次数一定要掌握好，否则不会有好的结果。可以先做预实验，取未做任何处理细胞一瓶，匀浆后差速离心分离胞浆和线立体分别做western
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发表于 2012-2-7 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

就是黄培堂翻译的那本细胞实验指南呀！司徒镇强的是细胞培养！
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