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标题:[求助]关于Hela细胞传代的疑问？

vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]关于Hela细胞传代的疑问？




今天对复苏后的Hela细胞进行了传代，培养瓶的底部有类白色的花纹，这是不是贴壁的Hela细胞？

我加入0.25％胰蛋白酶消化，摇晃后，结果出现了很多碎片，碎片肉眼就可以看到，然后加入DMEM培养液终止消化，传代，可是有很多碎片，请问，这是不是正常？

如果用于做MTT试验，怎么把能使消化后出现单个Hela细胞？

我是新手，希望各位老师帮忙解答。谢谢
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你消化的有点过了，消化的正好应该是在显微镜下观察大部分细胞都分开，细胞没有贴壁时的形态，但细胞还不能飘起来。
每次传代最好离心一次，然后吹打，碎片就会很少了，至少肉眼看不到。
单细胞悬液最好用个细胞筛(如200、400目等)，用前消毒。
你做MTT，反复吹打， 然后记数加板就可以了。
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 园丁## 的帖子

谢谢 ！

可是我的细胞是飘起来后还堆在一起啊，就是一整块飘起来了。
这个怎么办呢？在10*40倍显微镜下看到漂浮的整块是Hela细胞，
我该怎么办呢？过滤吗？
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caihong[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是胰酶时间长了,我前一段时间也遇到了和你一样的问题.胰酶放了有几个月了,我想即使活性有所下降我多加点就是了,可是细胞是消化下来了,都是大片大片掉下来的,吹都吹不开,吹多了细胞就有很都碎片和小黑点.细胞也长的很慢.后来有一次我的胰酶忘了解冻,我就借了我同学的用了一下,奇迹发生了!细胞不再成片成片掉下来,而是细胞间连接消失,细胞变圆,消化下来之后细胞轻轻吹打一会细胞就分散的很开了.后来我问我同学,他说胰酶放的时间不能太长,每次少配点,分装后冻起来,如果细胞喜欢成团的话就加点EDTA,他的胰酶里面就是加了的.
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #4 caihong 的帖子

我的胰酶是新配制的啊，不过书上说要冰箱中放置一夜或者试问4小时（不停的搅拌），我的胰酶配制好了以后就搅拌了30分钟，这个有影响嘛？

我的细胞是不是因为吹打不够啊？我只是用力摇晃了，发现细胞块都悬浮了。就没有再摇晃，如果继续吹打，细胞应该可以分开吧？
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
主要还是消化过了，否则不会成片脱落。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们配好了就是放在-20度的,用的时候再拿出来.
细胞消化的时候应该放在显微镜下看或者是放在孵箱几分钟再拿出来看啊,你在显微镜下应该看到细胞变圆,细胞间连接消失,倒掉胰酶然后加培养基中和的时候细胞就会纷纷掉下来的,你用力摇晃干吗呢?然后再吹打几下就好了.
另外是不是你配的浓度有问题啊,你配的浓度是多少啊?用什么配的?有没有加EDTA?
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #7 pengke1983 的帖子

我用力摇晃是为了让贴壁的细胞脱落下来，应该跟吹打的效果差不多啊。

我用的胰酶浓度0.25％，用D-hanks配制的，没有加入EDTA。

另外，我没有倒掉胰酶，直接加入的培养基，书上说只要加入血清或者带有血清的培养基，胰酶就会停止消化。

如果倒掉胰酶，那么消化下来的细胞不也一起倒掉了吗？
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兔唇[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的细胞以前是菱形的，传代以后怎么变成圆形的，这个正常吗？
我该怎么办呢 ？


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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-2-8 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

成片漂起是因为没有及时传代，细胞的密度太高了。
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