小中大介绍一下我的方法：
1.DCFH-DA配制
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无 荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
DCFH-DA分子量：487.29 g/mol，我买的是sigma的，很便宜。文献使用的终浓度为5－50uM，一般用10uM，我使用的是20uM，建议正式做实验前先摸个DCFH-DA的合适浓度。用DMSO配成20mM母液，－20度冻存。
2.方法
加药处理完（我从收细胞到检测需要操作3小时）
1，消化收集细胞，注意连上清一起收集，收集所有的细胞，放入EP管。
2，温PBS洗一遍。
3，用无血清培养液按1000:1配DCFH-DA，每个样本需要1ml工作液，预温。
4，每个样本用1ml工作液重悬
5，将EP管放入培养箱，孵育20min－1h，我孵育30min。每隔3-5分钟颠倒混匀一下。
6，离心收细胞，温PBS洗3遍，注意弃尽上清，因为DCFH-DA本底很高。
7，1ml PBS重悬，上机检测，使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用。
3.注意
1，收集细胞要完全，连同培养液上清一起离心，这是收集细胞的常规操作。
2，预温的试剂室温其实就可以了，不要用冰的，这样会影响DCFH的反应。
3，对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先用DCFH-DA处理，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后用DCFH-DA处理。我处理时间是24h，所以先处理，后用DCFH-DA。
4，由于我的药物会使细胞漂起来，所以采用消化收集细胞的方法，收集所有细胞，但洗细胞的时候很麻烦。如果细胞贴壁很好，就不要这么麻烦了。直接在平皿里洗洗，DCFH-DA处理，再洗洗，再消化收集细胞，上机检测。操作很简单。
5，实验过程不需要避光。
