[求助]]关于PI单染！

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标题:[求助]]关于PI单染！

00无名指00[使用道具]
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发表于 2012-2-9 11:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我第一次接触流式细胞仪，准备用PI单染法检测悬浮的细胞周期和晚期凋亡率，现有几个关于流式PI单染的问题向各位高手请教！
１）－２０度７０％乙醇固定细胞时是过夜好还是２小时好，固定后可以放在－20度冰箱么，还是放在4度冰箱，最长能保存多长时间，时间太长对检测结果会产生怎样的影响；
２）有的书上提到染色前要用DNA抽提缓冲液作用５分钟，这个缓冲液是不是就是所谓的PC液，因为我看两者的成分是一样的，能用0.5%TritonX-100 的PBS代替么；如果配置的ＰＩ染液内含有TritonX-100,还要加ＰＣ液么；
３）加ＰＩ的量是根据什么来计算的；
４）书上说加PI 30分钟后即可上机检测，但有的人说加PI后只要避光能保存１－２天，是这样么？
5）细胞的前期处理需要使细胞同步化么？
多谢！

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2012-2-9 11:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1，过夜！－20度！几个月没问题，超过半年没试过！
2，就是PC buffer！不能代替！抽提和破膜是两个概念！抽提时间30min，有的书上要冰浴，有的不要，我的经验是：都可以！
3，1×PI，10的6次方个细胞5ul ！
4，我们实验室是室温，避光，1h！可以保存，但不是必须保存，保存时间长了后，cv值不好！
5，根据试验要求定！

好运！

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发表于 2012-2-9 11:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢园丁##！在此之前Search过的，因为对有些问题还很模糊，所以还是想确定一下！我还想请教一下，亚G1峰检测、晚期细胞凋亡率及细胞周期检测用的都是PI单染法，这几项指标对细胞的处理有何不同？我在书上看到的是前者需要DNA抽提，但是后两项检测则要破膜，师姐则说不需要破膜，她自己做的效果也不错！我今天第一次去做流式，没有用破膜剂，那老师也没有说什么，是不是说破膜不是必须的？

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发表于 2012-2-9 11:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室流式技术应该说是很强的，而我们的试验也主要是根据流式而展开！用PC buffer的目的主要是使凋亡细胞内的低分子量的DNA抽提得更加充分，使凋亡细胞与非凋亡细胞在大量存在的同时不出现重叠！

我个人建议使用！

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发表于 2012-2-9 12:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

又有几个很菜的问题要请教：
７０％乙醇怎么配制，可以用纯水么，有人说用专用的盐水，这个盐水又是什么？园子里有的说可以直接用７５％乙醇，是医用酒精么，还是要用无水乙醇另外配制，还有的说用８０％的！

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发表于 2012-2-9 12:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以告诉您的是：
70～80％的冰乙醇！
您看看75％的冰乙醇的物质含量！就是瓶子上贴的标签，一大堆乱七八糟的东西，能用吗？

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发表于 2012-2-9 12:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我已经在司徒镇强的细胞培养书内找到了盐水G及70％乙醇的配置方法了，师姐说用盐水G配置的目的是保持一定的渗透压，以免照成细胞破裂，但我仍然很奇怪，我就是用95％乙醇加蒸馏水配的80％乙醇，昨天固定的，今天取一滴细胞悬液观察，细胞形态很好，前天那一次也一样！是不是不一定要用盐水G配也可以？

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发表于 2012-2-9 12:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

的确有这样的现象，按道理应该是用PBS这样的等渗液体配置，但是实际上配置后渗透压也会变化！？我的化学没有学好，不知哪位可以帮忙解答一下！
您说的现象我也见过，而且自己也试过，用PBS配置和用双蒸水配置的在试验结果上看不出固定效果的差别，但是我并没有往下想，故不知何故。现在猜想：冰乙醇固定迅速，所以细胞来不及因为渗透压的变化而破裂就被固定？

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发表于 2012-2-9 12:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最后讨论结果为：
1，用PBS和双蒸水都可以，因为结果证明可以！
2，原理就是我上面猜想的，酒精迅速固定造成渗透压对细胞影响很小或没有影响。
3，另外由于冰乙醇的脱脂作用，膜出现空隙造成渗透压对细胞的影响消失！

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发表于 2012-2-9 12:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也想做流式来检测细胞的凋亡，是Hoechest和PI双染好还是单用PI单染？不知道流式测凋亡好检测吗。

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