[讨论帖]细胞损伤模型

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标题:[讨论帖]细胞损伤模型

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发表于 2012-2-9 13:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在很多实验都涉及到细胞损伤模型的建立和运用，如CCl4诱导肝细胞损伤模型（体内、体外）、PC12细胞的NO和淀粉样蛋白(Aβ)损伤模型、神经元缺血再灌注损伤模型，以及脉络宁对骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用等。
请有相关实验经验者就模型的建立方法、模型评价、注意事项等发表高见，也可就模型建立过程中遇到的具体问题向园内其他群友求助。

一叶[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）

　1　大鼠肝细胞的分离和培养　大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105　U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。

　　将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。

　2　CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16　mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

　3　H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

　4　检测指标

1  AST、ALT的测定　培养的肝细胞经离心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清，按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST和(或)ALT活性，结果以U·(106 cell)-1表示。
2  肝细胞增殖试验　采用MTT比色法。

3  肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性的测定　先制备GSH标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 min后，离心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液（肝细胞样品）0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂空白管，加入各种试剂。混匀后立即计时，静置12 min后，以样品空白管调零点，于423 nm波长处读得吸光度（A）值。在GSH标准曲线上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位是在37℃，pH6.5条件下，每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位。计算公式为：GSHpx活力单位=（［GSH］非酶管-［GSH］样品管-［GSH］试剂空白管）/3。结果以U·(106 cell)-1表示。

4  肝细胞丙二醛（MDA）含量的测定　先制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心（2 500 r·min-1，10 min），弃上清，加15％ TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入0.67％ TBA 2 ml，于沸水浴中加热30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度，结果以 nmol·(106 cell)-1表示。

5  数据处理　数据以±s表示，计量资料组间比较采用t检验。两变量间相互关系，采用直线相关和回归分析。

一叶[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再发一个体内肝损伤模型（酒精）

一、材料　纯系SD雄性大鼠，体重180g～200 g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。

二、方法　将大鼠随机分成5组，饲养在23℃～25℃室内，自由进食、进水；根据大鼠体重，A、B、C、D组每日用56°红星二锅头白酒以10ml/1Kg分别灌胃 0、4周、8周和12周；E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本。

三、主要指标检测

（一）肝功能：应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、球蛋白（Glb）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）等。

（二）氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）。

（三）大鼠肝脏病理检查：大鼠处死后立即取出肝脏，称重后一部分以10%的福尔马林液固定作病理，作常规石蜡切块并HE染色，在光学显微镜下进行观察，用半定量法分别判定脂肪变性、及酒精性肝炎炎症活动度

mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教各位大侠一个问题：想做过氧化氢致细胞凋亡的模型，查过一些资料说过氧化氢可以导致细胞凋亡，可是我做出来的流式细胞计数（PI单染色）图形象是坏死峰，亚二倍体峰离G1峰距离太远，老板认为过氧化氢导致细胞死亡就是坏死，与浓度没有一定的关系，肯定不是凋亡，我现在进退两难。
哪位做过这方面的实验啊？过氧化氢致ECV－304凋亡的浓度及作用时间是多少啊，到底能否导致凋亡吗？能否提供一些可以导致凋亡的证据啊，也好帮我说服老板让我继续实验啊！谢谢

一叶[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

H2O2当然可以导致细胞凋亡，不过剂量掌握不好就变成细胞坏死了。

检测细胞凋亡还是坏死是有方法的，建议你用pI ；dapi双染，请仔细查看本版的帖子。这样你老板就没话说了。

H2O2导致细胞凋亡的主要原因是氧离子导致细胞损伤，包括DNA损伤。

剂量需要做预实验，增加摸索。

mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

唉！就是不幸啊！老板太固执了！

坚持让我做DNA－ladder，只有出了ladder他才会承认是凋亡

现在我只有拼命在跑ladder啊！

ffooll[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想请教各位高人：细胞模拟缺血再灌注诱导凋亡的模型，我们学校的条件有限，只有三箱培养箱，没有那种缺氧罐，而三箱的氧浓度最低为1%，不能降到为0，而我看到许多国内的文献都用的是95%的氮气，5%的CO2，难道他们都有那种缺氧条件吗，并且如果考虑自制的话，还存在氧分压测量的问题，我觉得太复杂了，不知战友们都是怎么做的？不考虑化学缺氧。

qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

参考文献上说H2O2可以诱导凋亡,我用的是NEK52E,已经试过两次了,浓度设置是1-5mM,作用时间是1-2h.1h后观察,H2O25mM的细胞大片坏死,1mM细胞形态学也发生改变,细胞体积增大,很像坏死,用DAPI染色观察凋亡不明显(我照相了,等我拷过来就发上让大家看看).
我想再试验一下,调整一下过氧化氢的浓度和作用时间,再就是用DAPI染色没法区分坏死和凋亡,可能要换一下方法.
很希望与大家交流!

笑弯了腰[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞模拟缺血再灌注诱导凋亡的模型其实就是细胞缺氧复氧模型，很有趣咱们遇到了相同的问题，前一段时间我还在研究如何将三孔培养箱用于缺氧实验，直到咨询了专业人士才恍然大悟，三孔培养箱和缺氧培养箱是两个概念，三孔培养箱的氧浓度调节是受限的，氧浓度设置应高于大气氧浓度，一旦氧浓度下降，氧源可以补充，开关培养箱门也不会对氧浓度有多大影响，这就类似于二氧化碳培养箱中二氧化碳浓度的调控。但如果设置的氧浓度很低，用于缺氧实验通常小于1%，三孔培养箱实际上是无法达到这个条件的，设想一下反复开关培养箱门，培养箱内氧浓度肯定升高，但仍低于外界大气的氧浓度，如果没有一个负压抽气泵的话，怎麽可能使氧浓度降下来保持恒定呢？而真正的缺氧培养箱是具有一个抽气泵的，因此价格也要高的多。三孔培养箱则多用于特殊条件的培养，如高氧、高氮。
至于缺氧的简易装置，我以前的帖子详细解释过，你可以看看，不要着急，自己动手尝试一下，祝成功。

fqswdzd[使用道具]
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发表于 2012-2-9 13:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.四氯化碳体外损伤肝细胞模型
原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h（贴壁良好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳0.4M容积，37度90min，造成肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。(即熏蒸法)
肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并加入CCL4 8mM（事先用DMSO溶解，DMSO终浓度1％），作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性，评价损伤程度。（常用方法）

2.醋氨酚体外损伤肝细胞模型
肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继续培养12h，取培养液，进行下一步实验。

3.过氧化氢体外损伤肝细胞模型
肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量。

4.氰化钾缺氧肝细胞损伤模型
肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。本模型可以更好的模拟缺氧损伤。

5.硫代乙酰胺（TTA）体外肝细胞损伤模型
肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入TTA0.18mM，继续培养48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。

6.内毒素体外损伤肝细胞模型
贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素70uL/mL，置37度，5％CO2培养此时上清LDH活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体外肝细胞损伤模型。

7.半乳糖胺（GalN）体外损伤模型
分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液，继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT显著升高时，肝细胞造模成功。

参考《现代药理学技术》

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