[求助]心肌组织做annexinV/PI双染用流式细胞仪观测凋亡和坏死

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标题:[求助]心肌组织做annexinV/PI双染用流式细胞仪观测凋亡和坏死

bohe221[使用道具]
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发表于 2012-2-10 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位高手，本人打算做疾病模型小鼠心肌的细胞凋亡和坏死的观测，打算把心肌取下后做成细胞悬液，然后annexinVPI双染，走流式细胞仪。目前有以下一些问题：

1. 心肌组织制备成细胞悬液的具体步骤（越详细越好，我很笨），需要注意什么？

2.是用筛子筛好呢，还是用胰酶消化呢？园子里有个版主曾经发过帖子说消化尽量时间短才不会影响结果，但是到底时间是多少呢？

3.园子里的帖子里曾经有人说过：活细胞：FITC－/PI－；凋亡细胞：FITC+/PI－；凋亡后继发死亡的细胞：FITC+/PI+.
细胞凋亡率％=100×（凋亡细胞+继发死亡细胞）/全部细胞数

本人的疑问是为什么是FITC+/PI+是继发死亡呢？死亡就是死亡啊，怎么就继发呢？本来做annexinV和PI染色就是区别凋亡和坏死的，而且如果那样我的坏死率怎么算呢？请明示。

4.FITC －/PI+的细胞是什么呢？机械损失的？PS没有外翻而细胞膜破了？

5. 本人是北京的研究生，如果各位有在北京正在做这种类似实验的老师，能不能站内短信联系我？我想学习一下。谢谢了。

好了就这么多了，谢谢各位可以有耐心看完，而且希望大家留下你们的宝贵经验。谢谢了，实验的事情，我心急如焚。

麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-2-10 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没做过你的实验，不过挑能回答的谈谈个人的看法：
1. 有关"心肌组织制备成细胞悬液的具体步骤"？
不知你刚看过这个帖子没？个人认为你可以PM作者，应该会有帮助。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=8062383&sty=1&tpg=1&age=0')
2. "凋亡后继发死亡的细胞" ？
个人同意你的看法，凋亡和坏死是细胞两种不同的生命终结方式。鱼和熊掌，二者不可兼得！“凋亡后继发”死亡这个命名的确有点新鲜，可能作者要说的是晚期坏死吧。因为流式图上的“FITC+/PI+”代表的就是晚期凋亡和坏死的细胞。
3."FITC －/PI+的细胞是什么呢"?
从检测原理上来看，FITC －/PI+的细胞（如果还有细胞结构的“轮廓”的话）应该指的是细胞膜的通透性有损伤而没有膜的物理结构异常（PS外翻）的细胞如你说的机械性损伤的细胞，此外应该还包括一部分坏死的细胞。
一点个人看法，望高手继续讨论！

ROSE李[使用道具]
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发表于 2012-2-10 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

以前帖子里曾经有人说过：活细胞：FITC－/PI－；凋亡细胞：FITC+/PI－；凋亡后继发死亡的细胞：FITC+/PI+.
细胞凋亡率％=100×（凋亡细胞+继发死亡细胞）/全部细胞数

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本人的疑问是为什么是FITC+/PI+是继发死亡呢？死亡就是死亡啊，怎么就继发呢？本来做annexinV和PI染色就是区别凋亡和坏死的，而且如果那样我的坏死率怎么算呢？请明示。

首先：PI是染死细胞的DNA和RNA的。明确了这一点，以上的东西就好理解了。
其次：目前对于细胞死亡的机理的研究太多了。细胞可以通过凋亡死亡，也可以通过坏死死亡，还可以通过胀亡死亡等等。细胞凋亡后可以形成凋亡小体，可以在形成凋亡小体前崩解死亡，所以就会有继发死亡的细胞了。
第三：坏死和死亡不完全是一回事。坏死只是死亡的一种。

ROSE李[使用道具]
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发表于 2012-2-10 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

4.FITC －/PI+的细胞是什么呢？机械损失的？PS没有外翻而细胞膜破了？

==============

是坏死的细胞。

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-2-10 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前面的问题支持上面的说法！版内基本有详尽的说明。
每种细胞消化时间不一，需要在试验中摸索。

4.FITC －/PI+的细胞是什么呢？机械损失的？PS没有外翻而细胞膜破了？
不敢说是什么，下一次有时间，我把它们分选下来共聚焦看看！

说法太多，不敢乱发言！

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-2-10 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

继发死亡在这里是指死亡细胞是由凋亡而来的。也就是细胞有con的左下角逐渐逆时针经过右下角（早期凋亡）转到右上角（死亡细胞）。

toy[使用道具]
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发表于 2012-2-10 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于那个FITC －/PI+我很有感触。我将刚刚用灌流酶解法分下来的心肌细胞去做双染测凋亡。上机前，我滴了一小滴在镜下观察，发现杆状细胞不少约60％。但上机后发现，FITC －/PI+的细胞占80％左右，而FITC ＋和FITC —的细胞几乎没有，由此我判断刚刚分下来的细胞的膜没有恢复，通透性很高，所以pi可以进入细胞，其实细胞并没有死，而只是膜的机械损伤造成的。而且，凋亡细胞几乎没有，也支持这一点。
培养一天后，在上机，发现FITC －/PI+占20％左右，凋亡的细胞占4％左右，故第一天的80％是细胞膜的通透性问题。

plaa[使用道具]
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发表于 2012-2-10 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顶，我最近也在做这个，想知道，凋亡率指的就是FITC+/PI-这部分呢，还是像楼主说的是细胞凋亡率％=100×（凋亡细胞+继发死亡细胞）/全部细胞数，期待高人指点。