小中大我养过,但是是大鼠的,我的实验方法如下:
实验方法:
1.大鼠前脂肪细胞的原代培养:颈椎脱臼法处死大鼠,75%酒精浸泡消毒15min,切取皮下脂肪组织约10g。Hanks液洗涤,分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管。剪碎成约2mm×2mm的小块,加入消化液,置37℃,空气摇床100rpm消化。2hr后,1000rpm离心5min,去除漂浮的脂肪细胞及培养液,沉积的细胞用红细胞裂解液再次配成细胞悬液,37℃孵育10min,以去除污染的红细胞,150μ尼龙网过滤,Hanks液洗涤并离心2次,每次1000rpm,5min。沉积的细胞用培养基A制成细胞悬液,调节浓度2×105/ml接种于培养瓶中。置37℃,体积分数5%CO2培养箱内孵育72hr后,细胞换液,一周以后可以传代。
2.细胞的分化:细胞贴壁72hr后Hanks轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质,换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化,3d以后更换为培养基B,以后每三天换一次液。
培养基A(增殖培养基): DMEM/F12 11.2g/L
10%小牛血清,
L-Glutamin 0.35g/L
Hepes 15mmol/L
NaHCO3 15mmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
培养基B(诱脂培养基1):DMEM/F12 11.2g/L
NaHCO3 15mmol/L
Hepes 15mmol/L
泛酸盐 17µmol/L
生物素 33µmol/L
人转铁蛋白 17µmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
氢化可的松 100nmol/L
胰岛素 60nmol/L
T3 0.2nmol/L
培养基C(诱脂培养基2):DMEM/F12 11.2g/L
10%小牛血清,
IBMX 0.25mmol/L
L-Glutamin 0.35g/L
Hepes 15mmol/L
NaHCO3 15mmol/L
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
0.22µm过滤除菌,-20℃保存。
消化液:胶原酶Ⅰ 150mg
牛血清白蛋白 2g
0.01M的PBS定容至100ml
2.2红细胞裂解液:EDTA 0.1 mM
NH4Cl 150mM
K2HPO4 5.7mM
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