小中大[求助]大鼠肝脏Kupffer（枯否）细胞原代培养技术的几点疑惑
最近2个月，一直在做此实验，但做了多次后，发现原代培养效果不明显，获得细胞不纯，细胞不多。现将我的原代培养步骤及部分结果列举如下，请各位细胞培养高手以及做过此实验多多指点，在下不胜感激！
实验步骤：
一、大鼠肝脏Kupffer细胞原位灌注
1、以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；
2、常规消毒；
3、Na2S褪去腹部切口毛发；
4、开腹，以24G静脉留置针穿刺门静脉，尖端不超过门静脉分支处，固定牢靠；
5、推注肝素液10ml行肝素化处理；
6、以预热37℃的D-Hanks液（无钙、镁）按100ml/h的速度灌注；
7、待肝脏明显肿大约1倍后，剪开下腔静脉放血，保持灌注液持续灌注；
8、待灌注流出液清凉不含血液后，剪断肝周韧带，取下肝脏，连同门静脉置管移至无菌培养皿内。
二、Ⅳ型胶原酶消化
1、38℃预热0.1%Ⅳ型胶原酶（Hanks液配制，含钙、镁）经门静脉置管缓慢持续灌注，待肝脏消化变软，结构塌陷，修剪去肝包膜及结缔组织；
2、留胶原酶液在培养皿中，消化10分钟；
3、充分消化后，以小毛刷刷洗消化后的肝脏，吹打形成散落的细胞悬液。
三、将上述细胞悬液以200目细胞过滤网过滤至50ml离心管中
四、获取的细胞悬液约45ml经4℃100×g离心5分钟；取上清加入另一离心管中，以4℃400×g离心10分钟；弃上清，沉淀以10mlPBS液重悬后，吹打成细胞悬液，将其小心加入已配制好的25%/50%Percoll液面层上，4℃900×g离心20分钟；见液面分为四层，以吸管精细吸取原50%Percoll液面约15ml液体；加15mlPBS液，4℃800×g离心10分钟；所得沉淀以1640培养基重悬，接种于培养瓶中，置5%CO2、37℃培养箱中。
五、培养40分钟后，取出培养瓶，倒掉培养基，以PBS冲洗2次，镜下观察贴壁细胞，用10%1640生长培养基（含双抗）8ml培养。
实验结果：
1.percoll梯度离心失败，梯度密度之间没有白色的细胞带
2.贴壁筛选时间1h、2h、4h，发现筛选后，留下细胞均较少
3.培养的细胞形态较多较杂，因鉴定抗体（ED2）未到，所以暂时无法鉴定哪些细胞是Kupffer细胞
4.培养一周（2到3天换一次培养液）后，发现梭形、菱形细胞比例增多，而球形细胞比例下降
疑惑：
1.梯度离心的操作失败，是否是因为梯度密度设定的问题？
2.Kupffer细胞的正常形态是怎样？
3.为什么培养一周后，梭形、菱形细胞比例增多？
4.有没有谁做过的？老板说可以出差去学习学习，谢谢了
