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标题:[分享帖]贴壁细胞在载玻片上爬片的新方法(细胞爬片)

yysr238[使用道具]
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[分享帖]贴壁细胞在载玻片上爬片的新方法(细胞爬片)



本文摘自华北煤炭医学院05级病理学与病理生理学徐洪硕士论文
Skp2-siRNA对Eca-109食管癌细胞系增殖的影响

3.1.4 细胞爬片方法的改良
1)取1000µl tips若干,在其尾端剪下12mm长的筒管一个,重复制作得到若干筒管备用。
2)将得到的筒管用适量中性树胶粘贴到载玻片上,方向为原tips尾端(直径为8mm)朝下,断端朝上,在载玻片中下2/3的位置,成对称双行排列,同时粘贴4-6个筒管(见图1)。中上1/3位置为书写标记区域。
3)干燥固定后放入饭盒内进行高压灭菌消毒。超净台内制备细胞悬液,每孔放置细胞悬液400 ul。
4)置入无菌饭盒中,放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱孵育24h或按照实验设计的时间孵育。待细胞贴壁后去除筒管,用4%多聚甲醛将载玻片固定30分钟。
5)HE染色,镜下观察。

3.细胞爬片改良方法的实用价值
在实验过程中,我们根据细胞爬片的基本原理,通过实际操作,摸索并总结经验,对传统的爬片模式进行了改良。对于贴壁细胞来讲,提供一个合适的培养环境即可在平面(玻璃、塑料等)上贴壁生长。细胞如果能在盖玻片上贴壁生长,在载玻片上也一样可以贴壁生长的。两种爬片方法的比较见表5。

Table 5 The comparison between the traditionary method and the improved
method of cell culture

  传统方法  改良方法
载 体  盖玻片  载玻片
孔径直径/面积  16mm/201.06mm2  8mm/50.27mm2
实际爬片面积  96mm2  50.27mm2
所需培养基  1000µl/孔(24孔板)
3000µl/孔(6孔板)  400µl/孔
细胞种植密度  2×104~3×104/孔  5×103~8×103/孔
所需耗材  盖玻片、24孔板、载玻片  载玻片、tips
爬片效果  一般  较好
主要缺点  容易损坏爬片;脱水透明过程比较繁琐;不适合大量染色。  潜在的细胞毒性;粘片不牢会导致爬片失败;不太适合超过7天以上的连续培养。
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yysr238[使用道具]
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该改良方法的特点如上表所示:1)用材简便、价格低廉。载玻片、tips、中性树胶都是实验室常用的耗材,不需要购买相应的24孔板或6孔板,同时也不需要购买专用的细胞爬片。同时耗费的培养基和细胞都要比传统爬片方法要节省的多。2)爬片效果更好。实验中我们发现盖玻片爬片时,周边爬片效果良好,而中间位置容易出现不明原因的严重脱片现象,甚至出现盖玻片两面都贴上细胞的情况。改良后,细胞分布均匀,没有明显的脱片情况。3)操作简便。细胞在载玻片爬片最大的优点就是能够大批量的进行染色,如同普通石蜡切片一样。有研究人员用明胶[50]或者玻璃胶[51]将盖玻片爬片粘到载玻片上进行染色,或用琼脂糖包埋后进行石蜡包埋[52]后切片染色,这些都是变盖玻片爬片为载玻片爬片的方法,有利于后续染色的简便。传统爬片需要裁切与孔板相适宜的盖玻片或购买专用细胞爬片,在取出爬片时,经常会损坏爬片。在透明过程中,如果不取出爬片,二甲苯则会溶解孔板。项晓人等[53]研究的大批量培养细胞爬片的染色方法的简易装置仍是针对传统的细胞爬片,使用橡胶管固定爬片,会出现在二甲苯中胶管容易老化的现象。程光等[54]的细胞爬片病理处理湿盒装置和李宏等[55] 高密度阵列式细胞爬片培养装置、贮存装置及实验装置,也都是针对细胞爬片中的繁琐过程设计的,但存在现尚未市场化和比该方法造价高的问题。5)改良的爬片方法与传统爬片方法一样,可以进行连续培养,并可进行诱导或加药。因为筒管与载玻片之间用中性树胶粘贴,比较容易出现粘贴不牢的情况,连续培养应在7天之内,这是不如传统爬片的地方。尽管使用中性树胶作为粘贴剂,对细胞可能存在潜在毒性,如果短期培养则不受影响。
总之,我们认为,对短期(七天以内)的细胞爬片,改良方法较传统爬片方法具有用材简单、价格低廉、爬片效果好、操作方便等优点。

50.郑海燕,惠京.一种培养细胞免疫组织化学染色方法的建立[J].天津医科大学学报,2001,3(7)418-419.
51.尚宏伟,王兴翠,张立新.一种培养细胞免疫组织化学染色方法[J].首都医科大学学报.2005,27(5)695-696.
52.郑晖,肖德胜,蒋海鹰.培养细胞免疫组化方法的改进[J].细胞生物学杂志.2003,25(1):63-64.
53.项晓人,姜海英,赵喜新等.大批量培养细胞爬片染色的简易装置[J].解剖学研究,2002,24(4):312.
54.程光,张赟,章翔等.一种细胞爬片病理处理湿盒装置[P].中国.物理.200520078836.X.2006.11.08
55.李 宏,刘 佳,孔庆友等.高密度阵列式细胞爬片培养装置、贮存装置及实验装置[P].中国. 200610047607.0.2007.03.14

华北煤炭医学院中心实验室所培养细胞用此法爬片:Eca109食管癌细胞株在培养箱中孵育24h及48h;HK-2肾小管上皮细胞株分别孵育48h、72h及96h;SHG-44脑胶质瘤细胞孵育96小时;脐带血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞分别孵育24h,均未发现细胞污染和增殖受限,细胞状态良好,细胞直接爬片于载玻片,未有明显脱片现象。

该方法已写成论文,被《中国应用生理学》收录,预计明年发表。
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这个算 手工制作的chamber slide吗?很厉害
有2个问题,
1. 饭盒内进行高压灭菌消毒 是不是养的时候这个slide一直放在饭盒内,以达到密闭空间,达到无菌条件?
2. tip毕竟面积有限,细胞数会不会太少?
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请问用盖玻片能做爬片吗?
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这个算 手工制作的chamber slide吗?很厉害
有2个问题,
1. 饭盒内进行高压灭菌消毒 是不是养的时候这个slide一直放在饭盒内,以达到密闭空间,达到无菌条件?
2. tip毕竟面积有限,细胞数会不会太少?

==============================================================================================================

第一个问题:是的,这个slide一直放在饭盒内,不过观察的时候可以在超净台内打开,然后拿出来在相差显微镜下观察,在短时间内暴露在空气中一般不会污染。注意手部的清洁就可以了。

第二个问题:按照合适的细胞数目种植,如果觉得细胞数目少,可以多种一些么,讨论部分中的表格有参考细胞数目,如果做增殖实验,最好初始少种一点,如果做抑制实验,初始可以多种一些,毕竟有面积导致的增殖受限的情况出现。这个1mi tips在光镜下正好是一个低倍视野。
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请问用盖玻片能做爬片吗?

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常规就是用盖玻片进行细胞爬片,讨论中有叙述。
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徐洪,宋旭东,李莹,等.贴壁细胞在载玻片上爬片的新方法.中国应用生理学杂志,2009,25(2):283-284.
谢谢引用
呵呵
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贴壁细胞在载玻片爬片的新方法

徐 洪1,宋旭东1△,李 莹2,代 健1
(1.华北煤炭医学院 病理学教研室,2.血液内科教研室,河北 唐山 063000)

摘 要 目的:对传统细胞爬片方法进行改良。方法:利用1ml蓝枪头和载玻片制作,在载玻片上种植细胞制成细胞爬片,进行后续染色。结果:细胞直接爬于载玻片上,未发现细胞污染和增殖受限。与传统爬片相比细胞脱落少。结论:与传统爬片染色方法相比具有用材简单、价格低廉、爬片效果好、操作方便等优点。
关键词:细胞爬片;细胞培养
中图分类号:R36 文献标识码:A 文章编号:1000-6834(2009)01-

The New Method of Cells Growing on the Glass Slide

Xu Hong1 , Song Xudong 1, Li ying2 , Dai Jian1
( 1. Department of pathology , North China Coal Medical University , 2. Department of Blood
Internal Medicine, Heibei province , Tangshan 063000 , China )

ABSTRACT
Aim : To improved the method of cell growing on the slide . Methods : Cells were planted in a system making by 1 ml tips and slide . Result : Cells grow on the slide directly , no pollution and well proliferation , was fewer dropped off the slide than the traditionary method . Conclusion : The improved method had the advantages including easy-material , low-price , well-effect and convenient-operation , prior to the traditionary method .
KEY : cell growing on the glass slide ; cell culture
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在细胞培养中观察细胞形态时,除了使用倒置相差显微镜以外,还需要进行普通或者特殊染色,这时候就需要制作细胞爬片。常规的制作贴壁细胞爬片的方法,经常是在装有盖玻片或专用细胞爬片上种植爬片,在染色过程中操作起来比较繁琐。经过多次实践,对传统爬片方法进行改良,研究了一种在载玻片上直接进行爬片的方法,与市售Lab-Tek腔室玻片原理相同,现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料
普通载玻片和1ml tips若干。细胞:Eca-109食管癌细胞株(华北煤炭医学院中心实验室保存)。
1.2 方法
取1000µl tips若干,在其尾端剪下12mm长的筒管一个,重复制作得到若干筒管备用。2)将得到的筒管用适量中性树胶粘贴到载玻片上,方向为原tips尾端(直径为8mm)朝下,断端朝上,在载玻片中下2/3的位置,成对称双行排列,同时粘贴4-6个筒管(见图1)。中上1/3位置为书写标记区域。干燥固定后放入饭盒内进行高压灭菌消毒。超净台内制备细胞悬液,每孔放置细胞悬液400 ul。置入无菌饭盒中,放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱孵育24h或按照实验设计的时间孵育。待细胞贴壁后去除筒管,用4%多聚甲醛将载玻片固定30分钟。HE染色,镜下观察。同时用传统方法进行爬片,镜下观察并比较。
2 结果
用此种方法爬片,细胞直接爬于载玻片上,未发现细胞污染和增殖受限,细胞生长状态良好、分布均匀,无明显脱片现象(图2)。图3为传统爬片,可见部分细胞脱落。与传统爬片方法相比,具有用材简单、价格低廉、爬片效果好、操作方便等优点。
3 讨论
在实验过程中,根据细胞爬片的基本原理,通过实际操作,摸索并总结经验,对传统的爬片模式进行了改良。对于贴壁细胞来讲,提供一个合适的培养环境即可在平面(玻璃、塑料等)上贴壁生长。细胞如果能在盖玻片上贴壁生长,在载玻片上也一样可以贴壁生长的。
与传统爬片方式相比,该改良方法有如下优点:1)用材简便、价格低廉。载玻片、tips、中性树胶都是实验室常用的耗材,不需要购买相应的24孔板或6孔板,同时也不需要购买专用的细胞爬片。24孔板的直径16mm,底面积201.06mm2,实际爬片面积与放入其内的裁切好的盖玻片有关,一般为96mm2;而改良方法爬片面积与筒管直径有关,一般1ml枪头直径为8mm,爬片面积为50.27mm2。24孔板需要培养基1000µl/孔,密度为2×104~3×104/孔;而改良方法400µl/孔,密度为5×103~8×103/孔。比较起来,改良方法耗费的培养基和细胞都要比传统爬片方法要节省的多。2)爬片效果更好。实验中我们发现盖玻片爬片时,周边爬片效果良好,而中间位置容易出现不明原因的严重脱片现象,甚至出现盖玻片两面都贴上细胞的情况。改良后,细胞分布均匀,没有明显的脱片情况。3)操作简便。细胞在载玻片爬片最大的优点就是能够大批量的进行染色,如同普通石蜡切片一样。有研究人员用明胶[1]或者玻璃胶[2]将盖玻片爬片粘到载玻片上进行染色,或用琼脂糖包埋后进行石蜡包埋[3]后切片染色,这些都是变盖玻片爬片为载玻片爬片的方法,有利于后续染色的简便。传统爬片需要裁切与孔板相适宜的盖玻片或购买专用细胞爬片,在取出爬片时,经常会损坏爬片。在透明过程中,如果不取出爬片,二甲苯则会溶解孔板。项晓人等[4]研究的大批量培养细胞爬片的染色方法的简易装置仍是针对传统的细胞爬片,使用橡胶管固定爬片,会出现在二甲苯中胶管容易老化的现象。李宏等高密度阵列式细胞爬片培养装置、贮存装置及实验装置,也都是针对细胞爬片中的繁琐过程设计的,但存在现尚未市场化和比该方法造价高的问题。如果购买专门的Lab-Tek腔室玻片则造价太高。4)改良的爬片方法与传统爬片方法一样,可以进行连续培养,并可进行诱导或加药。因为筒管与载玻片之间用中性树胶粘贴,比较容易出现粘贴不牢的情况,连续培养应在5天之内,这是不如传统爬片的地方。
载波片与筒管之间的粘贴剂要符合以下条件:(1)粘贴紧密,不渗夜,可以通过物理或化学方法方便分离;(2)可经受高压灭菌;(3)对细胞没有毒性作用。尽管使用中性树胶作为粘贴剂,对细胞可能存在潜在毒性,如果短期培养(5天之内)则不受影响。试验过程中,使用ECa-109食管癌细胞株、HK-2肾小管上皮细胞株、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、鼠胚肺成纤维细胞用改良方法进行细胞爬片,均未发现有细胞污染和增殖受限情况发生。也可以考虑使用甲基纤维素等无毒粘贴剂。
为了解决粘贴剂可能对细胞有毒性作用的问题,笔者认为,设计一个爬片装置:(1)可以高温消毒,重复使用;(2)装置上端为孔板/腔室结构,方便细胞培养;(3)下端为装入载波片结构,不使用粘贴剂,而使用卡槽等物理结构使载玻片与上端孔板/腔室结构紧密结合。这样就可以免除考虑粘贴剂对细胞毒性的影响。
总之,对短期(5天以内)的细胞爬片,改良方法较传统爬片方法具有用材简单、价格低廉、爬片效果好、操作方便等优点,非常适合推广使用。

参考文献
1. 郑海燕,惠 京.一种培养细胞免疫组织化学染色方法的建立[J].天津医科大学学报,2001,3(7)418-419.
2. 尚宏伟,王兴翠,张立新.一种培养细胞免疫组织化学染色方法[J].首都医科大学学报.2005,27(5)695-696.
3. 郑晖,肖德胜,蒋海鹰.培养细胞免疫组化方法的改进[J].细胞生物学杂志.2003,25(1):63-64.
4.项晓人,姜海英,赵喜新,等.大批量培养细胞爬片染色的简易装置[J].解剖学研究,2002,24(4):312.
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弱弱问一下,套筒的底部的面积是否允许中性树胶的存在?
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