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标题:[求助]说说你细胞培养的流程，购买试剂、分装...

了了[使用道具]
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发表于 2012-2-12 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]说说你细胞培养的流程，购买试剂、分装...



对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。
细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。
如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。
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发表于 2012-2-12 12:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！
养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！ 书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。
我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法）
（一）仪器的清洗
总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。 酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液）
可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。
不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。
消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。
今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。
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发表于 2012-2-12 12:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
顶一下。我也说说我的一些体会吧。
1、首先说清洗：对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、灭菌时保持密封。Tip头就容易了，插到盒子里，双层牛皮纸包好后直接高压灭菌就好了。
2、再说说除菌：我说的除菌主要是指溶液的除菌。如PBS、HEPES之类的一些缓冲剂和不含葡萄糖的盐溶液，可以配好以后直接高压灭菌。而大部分的溶液由于成分限制必须过滤除菌。我们实验室需要过滤除菌的溶液有：胶原酶、胰酶、各类血清、抗生素、G-418溶液、各类培养基、各类生长因子、丙酮酸钠、谷氨酰胺等.
3、关于各类溶液的配制：我列出我们实验室常用试剂的配方吧：
1XPBS：氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸二氢钠1.15克、磷酸氢二钾0.2克，加水至一升，调pH=7.4。这里我认为PBS的pH是最重要的一环，不可大意。
HEPES溶液：8克氯化钠、0.3克氯化钾、0.135克磷酸氢二钠、1克葡萄糖、5克HEPES加水900ml，调pH=7.4
抗生素：我们主要用青霉素和链霉素，一般用1XPBS稀释至1X105单位，-20度储存，用时直接加入培养基，工作浓度一般为1X102单位。
G-418：1克包装的G-418瓶中加入10mlHEPES溶液彻底溶解，过滤除菌后分装于EP管，-20度保存。
谷氨酰胺：L-谷氨酰胺29.2克，加Hanks‘BBS1000ml溶解，配成200mmol/L过滤除菌，4度保存，工作浓度1～4mmol/L。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
1XEDTA-胰酶：0.25克胰酶加0.1克EDTA完全溶解于500ml 1XPBS中，过滤除菌后分装于50ml离心管中，一管4度备用，其他-20度保存。我不太主张配成10X的母液，因为胰酶反复冻融后，效果会差很多。（EDTA很难溶，必要时候可放置过夜）
MTT：sigma公司出产，用1XPBS配成50mg/ml待用。MTT毒性很大，配置时务必小心。
各类培养基：现在我们实验室都是买GIBICO的粉剂自己配制。包装盒上会有配制方法，以及加碳酸氢钠的量。按说明来就是了。需要注意的是在配培养基前，最好先确保碳酸氢钠充分溶解，避免局部pH偏高或偏低。
再一个就是水的使用，一般配盐溶液，用三蒸水即可，而配制培养基务必用超纯水，并在使用前要高压灭菌。
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发表于 2012-2-12 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
4、关于培养基的选用：我养过的细胞株不多，权当抛砖引玉吧。
一般来说大部分细胞系我们都用高糖DMEM+10%FCS培养，我们实验室用该培养基的有：HepG-2、NIH-3T3、A549、Hela、C2C12、COS-7。特殊的，如P19Cl6用α-MEM+10%FCS，SGC-7901用RPMI-1640+10%FCS，293细胞则用MEM+热灭活的马血清。
对于贴壁不是很紧的细胞，用45%DMEM+45%α-MEM+10%FCS有奇效~
现附上前辈总结的帖子，希望对大家有帮助
5、操作中的一些小细节：
实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转5分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力 、CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)、无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。 水槽可添加饱和硫酸铜溶液，并定期换水。
6、血清的相关问题：
血清必须贮存于–20℃，若存放于4℃，不要超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，预留此膨胀体积之空间，以免容器冻裂。
一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
瓶装(500ml) 血清一定要逐步解冻: 4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份 去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。以我们实验室做的对照试验看，未灭活血清效果的确要好些。
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发表于 2012-2-12 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
7、贴壁细胞传代培养 ：一般步骤为：真空泵吸走培养基，1XPBS漂洗两次，加入1mlEDTA-Tripsin（100mm皿为例），37度放置数分钟，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量血清，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，离心后加入新鲜培养基，按比例转移至新皿。
细胞的传代最重要的是胰酶处理时间，若胰酶处理太久，容易造成细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。我谈谈个人经验：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落，2min足矣，P19Cl6和293细胞贴壁不紧，可在PBS漂洗后，直接换新鲜培养基打散。
8、细胞冻存及复苏 ：
首先说冻存液配方，常用的配方一般是两种——90%FCS+10%DMSO或70%培养基+20%FCS+10%DMSO。前一种较贵，而且后一种冻存效果也不错，因此本人一般选用第二种配方。对于比较脆弱的细胞则选用前一种冻存液。
冻存步骤比较简单，前期处理同细胞传代，只是在离心后是直接吸取上清，用手拍打离心管底部，加入适量冻存液使细胞完全悬浮后分装于冻存管。制后先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。 接着置于-20℃冰箱，约60min。置于-80超低温冰箱中放置过夜。 最后置于液氮罐中长期保存。 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
注意事项：
1>使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。2>冻存时要选处于对数生长期的细胞，这样效果要好很多3>不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。 4>注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。5>冻存液中的培养基要与培养时相同，避免细胞由于环境突然改变而死亡，在冻存管上也要标明培养基种类。6>冻存液不要预热。7>程序冻存盒非常好用，省事省时效果还好，强烈推荐冻存使用冻存盒。

细胞复苏的原则是快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体步骤：
1.将水浴锅预热至40℃
2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
4.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
5.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
6.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
7.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，
8.平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min
9.吸弃上清液。
10.向冻存管内加入1ml培养液，吹打制成细胞悬液。
最后将细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内12-24小时后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
注意事项：
1>复苏时选用的培养基要符合冻存管上标明的培养基。2>操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。3>自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉
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发表于 2012-2-12 12:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

真空泵中间接一个10000ml的大烧瓶啊~吸液的管子直接往烧瓶里漏，吸气的一头保证在液面以上就可以了

那要看你用什么真空泵了.我们实验室用的水泵,不会大量产热,即使是空转也没有关系.单纯用电机抽真空肯定是不行的.
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发表于 2012-2-12 12:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞传代培养（消化法）
具体操作：
一. 传代前准备：
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
三.吹打分散细胞：
1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
四.分装稀释细胞：
1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。
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发表于 2012-2-12 12:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天做亚细胞定位，突然想起一个细节问题：不知其他战友发现没有，有时候做定位时会发现有些细胞是在玻璃片的另一面。这是因为细胞传代时，玻璃片没贴在底部，细胞就落在了培养皿底和玻璃片中间。这样一来就会影响到观察和拍照。
我现在做亚细胞定位传代时，都会先在皿里滴两滴培养基，让玻璃片贴在底部后再将细胞悬液加进去，这就避免了以上现象。
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发表于 2012-2-12 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

养细胞的准备工作耗费了我好长时间。
1 、查资料总结需要的仪器设备（要找到型号、价格、购买途径）、试剂（厂商、型号、规格、价格、购买途径）、杂碎用品（价格、购买途径）
2、联系厂商购货，大型仪器还要填报建设项目申请表，等待学校招标。
3、着手建立实验室。缺少的东西还要和其他院系交流，争取合作。
4、因本人是实验室第一个做细胞的，还要找到其他老师，帮他们做试验，同时学细胞培养的知识。
MTT又是个细节问题极多的操作，做起来是需要一段时间摸索的。
整个流程下来好累啊！
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发表于 2012-2-12 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实,最好的方法就是借一本好的细胞培养书:薛庆善<<体外培养的原理和技术>>和司徒镇强编的<<细胞培养>>都很好.只有书上说的才是最详细的,很多东西可以知其然,并且知其所以然.固然,从其他人那里可以得到一些知识,但是为什么如此,不如此会有什么结果,比如:刷瓶子有什么用?泡酸有什么用?很多人只能够笼统的说灭菌,其实不尽然.当然,我的意思并不是说,知道这些很重要,而是强调,从书上我们能够获得最详尽最直接的知识.当书上说得不具体时,则可以来这里问问各位战友,有的放矢,方为上策
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