细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]转染融合GFP加压G418后怎么没有荧光了？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 14  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]转染融合GFP加压G418后怎么没有荧光了？

tieshazhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74105
精华 0
积分 338
帖子 436
信誉分 100
可用分 2916
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
1

发表于 2012-2-12 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]转染融合GFP加压G418后怎么没有荧光了？




请问我转染细胞，36小时能看到绿色荧光，但是加G418到0。5mg/ml后，细胞大部分能存活，但是加压48小时时已经看不到绿色荧光了，有荧光的只有少数一个囊泡（或者是死细胞）。
谢谢了！
顶部
yhz1973[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79832
精华 0
积分 439
帖子 538
信誉分 100
可用分 3540
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
2

发表于 2012-2-12 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 tieshazhang 的帖子

你没有单克隆化，是吧？呵呵。
顶部
gemei0115[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76303
精华 0
积分 530
帖子 658
信誉分 101
可用分 4191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
3

发表于 2012-2-12 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果想要用荧光显微镜观察的话,最好采用瞬间转染为佳.
理论上,转染GFP可在任何时间均可观察到. 但实际不是这回事.当然,如果一定要在G418筛选后再看的话,建议使用Confocal.
顶部
dotaaa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74170
精华 0
积分 461
帖子 621
信誉分 100
可用分 3880
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
4

发表于 2012-2-12 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做了相似的实验，所转质粒带的是EGFP，24小时后即有大量荧光，之后1:10传代，G418筛选，每天我都观察到了不少荧光，而且随着克隆的形成，荧光也排列成行。
既然你看到了荧光，说明转染过程和质粒问题不大，也不像是G418筛选的问题，因为大多都是这个浓度，如果之前你做了G418浓度预实验就更没问题了。可以肯定的是有荧光囊泡是死细胞。不知道你在转染之后有没有传代，个人觉得这步对筛选很重要。另外，是否还可以在你的质粒结构上找原因，比如你的GFP启动子、增强子以及GFP序列是否正确，因为GFP半衰期很长，你说36小时有荧光，48小时就消失了，觉得这个不像是GFP
顶部
缘yuan[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72882
精华 0
积分 218
帖子 176
信誉分 100
可用分 1626
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
5

发表于 2012-2-12 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能是你转染进去的质粒并不完整,GFP基因转进去了,而控制G418抗性的基因并没有转进去,所以加药筛选后细胞就哗啦啦地死掉了.我就遇到这种情况了.啊,辛苦了一个月的成果就没了,心疼啊!
顶部
zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
6

发表于 2012-2-12 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是新手,也准备做GFP转染,不过我想转神经元,请教各位用的是哪种转染方法,具体操作如何?多谢!希望大家不要嫌弃本人的无知!多谢!
顶部
tieshazhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74105
精华 0
积分 338
帖子 436
信誉分 100
可用分 2916
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
7

发表于 2012-2-12 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了相似的实验，所转质粒带的是EGFP，24小时后即有大量荧光，之后1:10传代，G418筛选，每天我都观察到了不少荧光，而且随着克隆的形成，荧光也排列成行。
既然你看到了荧光，说明转染过程和质粒问题不大，也不像是G418筛选的问题，因为大多都是这个浓度，如果之前你做了G418浓度预实验就更没问题了。可以肯定的是有荧光囊泡是死细胞。不知道你在转染之后有没有传代，个人觉得这步对筛选很重要。另外，是否还可以在你的质粒结构上找原因，比如你的GFP启动子、增强子以及GFP序列是否正确，因为GFP半衰期很长，你说36小时有荧光，48小时就消失了，觉得这个不像是GFP

===============================================================

谢谢你的解答！
我是在转染48小时后1：10传并加G418的，加后48小时就没有看到荧光了！！
顶部
tieshazhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74105
精华 0
积分 338
帖子 436
信誉分 100
可用分 2916
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
8

发表于 2012-2-12 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能是你转染进去的质粒并不完整,GFP基因转进去了,而控制G418抗性的基因并没有转进去,所以加药筛选后细胞就哗啦啦地死掉了.我就遇到这种情况了.啊,辛苦了一个月的成果就没了,心疼啊!

=========================

谢谢
我的细胞大部分没有死啊！
顶部
tieshazhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74105
精华 0
积分 338
帖子 436
信誉分 100
可用分 2916
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
9

发表于 2012-2-12 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你在转染之后有没有传代，个人觉得这步对筛选很重要。

=================

为什么很重要啊？
顶部
49888[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77494
精华 0
积分 776
帖子 1211
信誉分 100
可用分 6906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
10

发表于 2012-2-12 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

G418的毒性作用比较慢，作用48小时后还不足以杀死大部分细胞，一般得到4、5天后细胞才开始大量死亡。加压后有绿色荧光的细胞反而死了，可能正如楼上的一位朋友所说的，转进去的质粒不完全，有绿色荧光蛋白那一段，却没有抗性基因的那一段，所以无法形成对G418的抗性（也有转进去的只有抗性基因的那一段，而无绿色荧光蛋白的那一段，这样筛出来的克隆是没有荧光的克隆，我就曾经有这样的经历）；而有外源基因进入细胞，细胞会形成代谢负荷，使得无负荷的正常细胞具有生长优势，随着不断的传代，会占据有荧光的细胞的生长空间，故而含有荧光的细胞会越来越少。
顶部
 14  1/2 12››