[求助]Annexin V/PI流式检测细胞凋亡

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标题:[求助]Annexin V/PI流式检测细胞凋亡

toy[使用道具]
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发表于 2012-2-12 13:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用DAPI染色看到了凋亡，但是用Annexin V/PI做流式，结果是坏死的较多，而凋亡很少，正常对照也是这个样子，请教各位战友，这是什么原因？是不是我的操作有问题，消化的时间比较长致细胞坏死，老板分析多半是这个原因，建议我缩短消化时间，用PBS清洗的时候加一点血清和多聚甲醛，这样会是细胞膜稳定，请各位群友指教！

duoduo[使用道具]
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发表于 2012-2-12 13:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看来你的细胞是贴壁的了，贴壁细胞消化后膜就会受损伤，就是没有坏死也会PI阳性的，所以你最好是做一些形态学的。我的细胞也是贴壁的，第一次做也是这样，我就在让细胞贴在玻片上，不消化，在玻片上染抗体，就好像免疫荧光，然后荧光显微镜照相。缺陷是不能定量，只有通过其他方式，如PI染DNA或者M30，或者染线粒体，然后流式检测定量。

toy[使用道具]
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发表于 2012-2-12 13:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢，我已经用DAPI染过了，做了荧光照相，现在想做流式定量，我的细胞是贴壁的，因此消化损伤可能是PI大部分阳性的主要原因吧。那我怎么才能减少消化给细胞造成的损伤呢，请各位群友指教！

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-2-12 13:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最好能详细列出步骤才能让战友们分析操作是否有问题。

北风那个吹[使用道具]
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发表于 2012-2-12 13:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实贴壁细胞不太适做流式测凋亡，消化的时候总会有细胞膜损伤，造成假阳性高。可能胰酶消化比较关键，应注意不要消化过久过于强烈。我也在做Annexin V/PI测凋亡，凋亡倒是明显，但细胞坏死比例也很高。祝顺利！

jujuba[使用道具]
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发表于 2012-2-12 13:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位高手，应该消化多长时间？

lagua123[使用道具]
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发表于 2012-2-12 13:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以用EDTA+PBS消化细胞试试，因为它是通过争夺金属离子，不像姨酶直接破坏膜蛋白
机械死亡一定会有，主要是操作时小心一点，离心转速不要太高，混匀时不要太剧烈

附件

2012-2-12 13:59

65931793.snap.jpg (19.56 KB)

toy[使用道具]
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发表于 2012-2-12 14:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢，想请问一下，EDTA和PBS是怎么配的，浓度多大啊，消化时间大约多久，再就是流式的老师要求我在冰上消化，但是我发现这样会使消化时间延长，胰酶的活性下降，这样是不是就不用在冰上消化了呢？离心的时间和转速是多少，才能避免细胞的损伤啊？
很高兴与大家交流！谢谢各位群友的帮助！

lagua123[使用道具]
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发表于 2012-2-12 14:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

0.05%EDTA+PBS,一般消化5分钟，如果不下来就用枪打
我消化没有在冰上，离心2000RPM 5min

toy[使用道具]
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发表于 2012-2-12 14:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢，上周我又做了一次流式，结果显示，单纯Annexin-V标记的减少了，但是凋亡和坏死的无法区别，也就是大部分是Annexin-V,PI标记均为阳性，这种情况怎么办呢？谢谢！
改进之处是没有在冰上消化，消化时间缩短了，并且用PBS洗的时候加了一点4％多聚甲醛，吹打细胞动作较轻。

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