小中大我们是用来做cyto-c释放，方案如下，结果很理想，只是要超速离心，不知你们那里有没有超速离心机，如果不超离，得到的只是粗线粒体，对结果可能会有影响，为排除溶酶体和过氧化物体污染，必需超离。
线粒体与胞浆的分离
试剂配置
1）Buffer A ：250 mM sucrose, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidine, 0.28 u/ml apotinin, 50 µg/ml leupeptin, and 7 µg/ml pepstainA, pH 7.4 ；
2）Buffer B ：250 mM sucrose, 1 mM EGTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidine, 0.28 u/ml apotinin, 50 µg/ml leupeptin, and 7 µg/ml pepstain A, pH 7.4；
3）细胞裂解液：10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；150 mmol/L NaCl；5 mmol/L EDTA；1％ Triton X-100；1％ 去氧胆酸钠；1％ SDS；1 mmol/L PMSF；0.28 u/ml Aprotinin；50 μg/ml leupeptin；7 μg/ml Pepstatin A。
分离线粒体与胞浆蛋白
1）取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2×105/ml，接种于玻璃培养瓶中，分别在给予处理1.5 hr、3 hr、6 hr、12 hr、24 hr后收集细胞，冰冷的PBS洗两次；
2）将细胞重悬于Buffer A中，转移至1 ml玻璃匀浆器，放至冰浴中，上下抽拉30次；
3）离心（1000 g×10 min，4℃），弃沉淀，将上清移至一新EP管中；
4）离心（10,000 g×20 min，4℃），所得上清和沉淀分别为胞浆、线粒体粗品；
为排除溶酶体和过氧化物体污染，需做以下进一步处理：
5）将胞浆部分转移至超离管中，离心（100,000 g×1 hr，4℃），所得上清为纯化的胞浆；
6）将线粒体沉淀部分重悬于Buffer B中，离心（10,000 g×10 min，4℃），重复3次，所得线粒体沉淀于细胞裂解液中裂解；
7）分装以上蛋白溶液，-70℃保存。
紧接着就可以western blot了，试一试，我们实验室这个方法已经很成熟了，祝你好运。
