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标题:[求助]如何做siRNA才有效

泡泡[使用道具]
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发表于 2012-2-13 12:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]如何做siRNA才有效



各位战友，各位前辈：
我是在细胞中做shRNA筛靶，可是做了三条都没有效果，而且阳性对照对GAPDH都无干扰效果。后来又设计合成了三条siRNA,阳性对照是干扰belta-actin的，还是没有效果，我很着急。希望各位能够帮忙！
我的细胞hepa1-6细胞，做质粒的时候转染效率比较高，基本上50%的荧光。做化学合成的siRNA的时候，用cy3标记的siRNA做过转染条件的优化，转染效率也挺高，可是就是没有效果。各位能帮我分析一下问题出在哪里吗？
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中国特色[使用道具]
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发表于 2012-2-13 12:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

shRNA建议首先采用文献报道的序列，不太建议自己设计，成功率低。也可以让公司设计。
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-2-13 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 中国特色 于 2012-2-13 12:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

shRNA建议首先采用文献报道的序列，不太建议自己设计，成功率低。也可以让公司设计。

是让公司设计的，而且说是序列在国外也得到过验证的，可是在我这里就是没有效果，我觉得很奇怪。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好！你的问题我解决不出来，我马上就要开始做RNAi实验了，引物已让公司化学合成siRNA，我想请教一下您，做实验之前我需要怎么准备，所用的器皿和枪头之类的需要做RNase去除处理吗？做转染的时候也要避免RNase的污染吗？谢谢了！
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 shenkunjie 于 2012-2-13 13:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好！你的问题我解决不出来，我马上就要开始做RNAi实验了，引物已让公司化学合成siRNA，我想请教一下您，做实验之前我需要怎么准备，所用的器皿和枪头之类的需要做RNase去除处理吗？做转染的时候也要避免RNase的污染吗？谢谢了！ ...


我把枪头和EP管全部泡了DEPC的，你也可以买进口去RNase的器材，只要高压就可以用了。做的时候也尽量小心吧，其实我现在也不成功，所以也没有什么好的经验，希望能互相帮助
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guagua[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是你找的公司信誉度不好，其ShRNA 载体质量不好，建议找具有好的知名度公司吧，我自己做的ShRNA RV载体，没有什么问题，也用过实验室保种的阳性载体，都没出现问题
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 guagua 于 2012-2-13 13:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可能是你找的公司信誉度不好，其ShRNA 载体质量不好，建议找具有好的知名度公司吧，我自己做的ShRNA RV载体，没有什么问题，也用过实验室保种的阳性载体，都没出现问题 ...

请问您用的是什么载体啊？
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guagua[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也是从别的实验室拿来的Clontech 的PMSCV-neo载体
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831226[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

既然转染效率可以，应该是序列的问题，首先从文献中检索有无验证有效的序列，如果没有，可以购买国外公司预先设计合成的siRNA，例如Ambion的“Pre-design siRNA”三条中保证至少一条有效。国内的不敢说，即使序列设计正确也不能保证合成的正确。
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 831226 于 2012-2-13 13:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

既然转染效率可以，应该是序列的问题，首先从文献中检索有无验证有效的序列，如果没有，可以购买国外公司预先设计合成的siRNA，例如Ambion的“Pre-design siRNA”三条中保证至少一条有效。国内的不敢说，即使序列设计正确也不能 ...

用了国外文献验证的siRNA进行转染，还是没什么明显效果，用了50M和100nM都没啥效果都不知道该怎么办了
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