[求助]表皮干细胞的传代方法以及求传代后照片（高倍）

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标题:[求助]表皮干细胞的传代方法以及求传代后照片（高倍）

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发表于 2012-2-13 13:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

养大鼠表皮干细胞快4个月了，卡在传代的环节（四型胶原包被）。

文献中的传代方法0.25%胰酶+0.02%ＥＤＴＡ　３７℃　　５分钟细胞根本下不来，反复消化，吹打至少十多分钟才能使细胞脱壁；这样折腾后细胞状态相当差，单细胞形态改变，无典型克隆。

求前辈，同仁指点！

附上培养细胞的情况：

附件

2012-2-13 13:11

98615935.snap.jpg (264.88 KB)

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发表于 2012-2-13 13:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

原代P0D3 200倍

附件

2012-2-13 13:11

93244418.snap.jpg (283.93 KB)

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发表于 2012-2-13 13:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

P1D3 200倍消化方法：0.25%胰酶+0.02%EDTA 37℃ 9min，常温8min（观察、吹打）

P0D7 100倍 0.25%胰酶+0.02%EDTA 37℃ 5min 后还是这德行；右上角还有细胞没有回缩变圆，而那些变圆的细胞根本吹不下来，郁闷啊！（以上三幅照片不是同一批细胞，仅为文字提供图片材料）

求指教！最好能附上一张传代后的高倍照，让小弟开开眼界，成功传代后的细胞是神马样子！谢谢！　

附件

2012-2-13 13:12

11144523.snap.jpg (361.85 KB)

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发表于 2012-2-13 13:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Enzyme dissociation protocol for epidermal stem cells:
Adherent cells were then harvested, with 0.25% dispase II (for 3minutes) and then one or two subsequent treatments with trypsin-EDTA
(0.3% trypsin and 1% EDTA) at 37°C, gently pipetted to help dislodge thecells, with rapid trypsin neutralization to prevent cell damage,
isolated into a single-cell suspension

Morphology:
Figure 1 Primary fibroblast culture from newborn mouse skin.
A The initial spindle shaped fibroblast (asterisk) monolayer formed around the tissue explants (arrow) after 2–3 d, B Fibroblasts in confluence (3rd passage), (×200)

附件

2012-2-13 13:13

30367702.snap.jpg (51.25 KB)

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发表于 2012-2-13 13:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Figure 2 Epidermal stem cell isolation and culture, A, Cell suspension obtained by enzymatically separating keratinocytes from newborn mouse skin (×200). B, The rapid adhering cells after 10 min on a composite matrix made of type I collagen and fibronectin (×400).

附件

2012-2-13 13:13

29048820.snap.jpg (47.82 KB)

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发表于 2012-2-13 13:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Figure 3 Epidermal stem cell expansion and identification. A, Morphology of putative epidermal stem cells isolated from newborn mouse skin (×200). B, Immunofluorescence micrographs of putative epidermal stem cells showed expression of molecular marker β1 integrin in the cells (×400).

附件

2012-2-13 13:13

85292852.snap.jpg (28.96 KB)

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发表于 2012-2-13 13:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你给出的两篇文献我都看过，关于表皮干细胞传代的文献我自己也总结了一些，关于传代的描述都很简单，貌似传代不是问题，但是文献上的方法操作时重复不出来。

用中性蛋白酶联合胰酶那篇，限于实验室条件还未做过尝试。

希望前辈们能根据自己的经验给出消化方案的建议和细胞照片（文献中都没有给出传代后的高倍照）。多谢！

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发表于 2012-2-13 13:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主养细胞应该不是表皮干细胞，可能有许多对胰酶不敏感或已死亡的细胞，所以消化不下来。

wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上的答复让我非常忐忑啊！
那先请各位帮我看看我养的细胞像不像表皮干吧？

jujuba[使用道具]
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发表于 2012-2-13 13:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主是用的FAD培养基吗？据说用角质形成细胞无血清培养基培养出来的是KC，培养ESC的话5天后就会逐渐死亡。另外，哪位前辈知道如何能买到氢考和霍乱毒素？

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