小中大MTT法显色的条件是很重要的,这一点容易被我们所忽视,我总结了一下MTT显色反应的一些合适条件, 与大家一览.
1 pH 值对MTT 实验结果的影响:MTT 实验体系的pH 值是影响实验结果的另一重要因素。在偏碱性的环境中本底偏高,稳定性较差。随放置时间延长而升高;偏酸性试液 的实验结果比较稳定。
2 酚红和血清对MTT 实验方法的影响:酚红是一种pH 中性指示剂,血清是细胞生长必需的营养成份,两者都是细胞培养液的基本成份。酚红在pH7.0
以上试液中呈紫红色,在570 nm 有较大光吸收值。血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀,影响透光度。
3 异丙醇等用作Formazan 溶剂,无须酸化也能消除酚红的影响: 为了消除酚红对MTT 实验结果的影响,Mosmann (1983) 提出用酸化异丙醇作Formazan 溶
剂,酸化异丙醇可将酚红显示的紫红色转变为无色。Francois (1986) 认为酸化异丙醇溶解Formazan 改变了原光谱特性,降低灵敏度,提出改用无酚红的培养基。未经酸化的异丙醇在一定条件下也可以消除酚红的影响。异丙醇等有机溶剂本身为弱酸性 ,能够中和中性和弱碱性试剂,如RPMI21640 (pH7. 3) 。当异丙醇与RPMI - 1640 的溶量比达到1∶1 以上时即可将酚红的紫红色转变成无色。
4 细胞代谢酶存在部位对MTT 实验结果的影响:细胞线粒体产生的琥珀酸脱氢酶是细胞生长代谢产物,这种酶裂解MTT形成Formazan 是MTT实验方法的理论基础。琥珀酸脱氢酶的产生和分布规律与MTT检验方法的灵敏度和稳定性有很大关系
5 MTT使用浓度选择:在不饱和状态下,或是细胞密度一定,MTT 不饱和;或是MTT一定,细胞密度不饱和,Formazan 的生成量分别与MTT浓度和细胞分泌的酶活性量呈线性关系。达到饱和状态以后,两者为非线性关系。为了提高MTT 实验方法的灵敏度,在细胞密度一定的条件下,应该使用MTT饱和浓度。MTT的饱和浓度与细胞种类、细胞活力状态有关因此MTT 最佳使用浓度要视情况而定。
6 MTT的酶裂解反应时间选择:MTT 在细胞培养体系中被细胞内线粒体产生的琥珀酸脱氢酶裂解生成Formazan ,完成这一反应需要一定时间。MTT 裂解反应2.5h 反应已基本完成,3 h 反应相当完全,通常MTT实验应选择3 小时的反应时间。
附注(对MTT性质做一些补充说明,它的理化性质对其条件影响很大):
MTT是一种黄色粉状物,溶于水性溶剂,也溶于有机溶剂,但在有机溶剂中的溶解力低于水性溶剂,常温下需要较长时间才能溶解。MTT 水溶液在pH 7.0 以下稳定,3～5周内不变性,在pH7.0 以上溶液中不太稳定 ,在异丙醇溶液中1 周内变色,2～3 周内变成兰紫色。MTT 溶液呈黄色,在410 nm 波长处有最大吸收峰,随波长增大吸收值很快下降,至500 nm处趋于最低值。MTT由酶裂解生成Formazan。Formazan 不溶于水性溶剂,易溶于有机溶剂。乙醇,丙醇,异丙醇,乙二醇甲醚,DMSO 等都是比较好的溶剂,Formazan 的有机溶液呈兰紫色 。细胞
增殖实验通常在聚苯乙烯培养板上进行,四氯化碳、10 %SDS 和二氧六环对培养板有溶蚀性,不宜使用。
DMSO 和SDS 对Formazan 也有较好的溶解性,但凝固点太高,10 ℃以下不能用; 丁醇等长碳链醇溶解Formazan 后与水相不混溶,呈分层液,不适合作Formazan溶剂。
