小中大[求助]大鼠胸主动脉血管内皮细胞培养的很多问题和细节
大鼠胸主动脉血管内皮细胞培养取材预备方案
一 提前一天打电话约SD大鼠（150-180g）。
二 准备相关物品和试剂
六孔培养板1个或提前高压灭菌小玻璃培养皿4个
25cm2塑料培养瓶2个
无菌包装注射器2支
高压灭菌并烤干吸管筒子2个
高压灭菌并烤干酒精桶1个
无菌封装手术刀片1个
塑料培养皿1个
高压灭菌并烤干手术器械1套
高压灭菌并烤干大玻璃皿2个
双倍双抗PBS(200U/ml)
DMEM培养液1（含100U/ml青霉素和链霉素，100U/ml肝素，1mlECGs，20%胎牛血清）
DMEM培养液2（含100U/ml青霉素和链霉素，5%胎牛血清）
肝素PBS溶液（1000U/ml）
明胶PBS溶液（1%）（1g溶于100mlPBS，37℃水浴箱过夜，0.22um滤膜过滤后在4℃保存）
三 操作流程
1 25 cm2培养瓶中预先加入1%明胶溶液4ml，4℃过夜，使用前放入37℃，5%CO2培养箱中至少60分钟，2小时更佳。
2 操作台和培养室中放入操作所需六孔板、注射器、吸管桶、酒精桶、手术刀、塑料培养皿、大玻璃皿、碘伏棉球缸，紫外灯照射至少30分钟，操作前检查操作台负压吸引是否打开。
3 取出PBS、培养基和肝素钠溶液，用酒精棉球擦拭瓶子和瓶口，放入无菌操作台；取出培养箱中的铺被明胶的培养瓶。安装负压吸引管，安装取液大吸管。
4 吸弃培养瓶中明胶，瓶口稍盖上。打开PBS，吸取10ml加入六孔板1、2、3号孔，每孔3ml+，吸取10ml加入4号孔及培养瓶中。稍冲洗培养瓶壁，吸弃PBS。
5 取培养基1 5ml，于培养瓶中加2ml，6号孔加入1ml，塑料培养皿中加2ml。轻轻摇晃冲洗配样瓶，吸弃培养基，并敞开放在台子后方吹干5-10mim
6 整理台面，撤出PBS、培养基1，六孔板和塑料培养皿合上盖子放在不易触及部位。
7处死老鼠，大酒精缸中倒入75%酒精浸泡2分钟，提起沥干酒精放入大玻璃皿中，用碘伏消毒口到尾部的皮肤。小酒精缸中倒入75%酒精。
8 用大剪刀和镊子剪开皮肤，钝性分离皮肤筋膜，充分暴露胸腹腔，将大镊子和剪刀稍过火后开始剪断胸骨并剪去左侧的肋骨及腹部肌肉，充分暴露脊柱。大剪刀及镊子置无菌玻璃皿中。
9 吸取无菌肝素溶液1ml，缓缓注入左心室。取眼科直镊和弯镊各一个，小心分离沿脊柱左侧走行的主动脉，从主动脉弓部一直分离到髂总动脉分支处，立即投入含有双抗的PBS六孔板1号孔内。
10 吸取肝素3ml，冲洗去管腔中残留血液，转入2号孔，找到裸露的血管头，一端用镊子夹外层脂肪筋膜可袖套样撕下，转入3号孔将小的筋膜尽量去除。转入4号孔，用弯剪剪开血管放入5号培养基孔中。
11 形成组织块
随机贴块法
用直剪将血管剪成碎片，大约1mm3,用吸管吸取平铺于培养瓶底部，铺匀，间距大于5mm。使用牙科探针使组织块平展贴在瓶底平面。
内膜向下贴块法
将血管片转移入小培养皿中，加入培养液使血管片可以浮起并平铺使内膜面向下，用手术刀切割血管片，尽量切小，一般块大小2-3mm左右。用牙科探针将切好组织块挑起放入培养瓶，使内膜向下平铺。
我现在在摸索使用剪刀剪已经剪成长片状的血管方法，也可以剪得比较小，大约可以剪到20块左右，剪完后用弯镊子夹到培养瓶口，用牙科探针铺好并展平使内膜向下，主要原因是剪完的血管通常蜷缩一团，但都向内膜面卷缩，所以铺的时候用牙科探针压平应该就是内膜面向下了，个人感觉块越小越容易成活及爬出细胞，大了营养不好，而且可能分泌出不利于细胞生长的物质。但是剪刀剪很小到1mm这个级别很难，最多2mm，大多3mm，我在想用一块高压灭菌的木块垫在下面，用新开封的手术刀或者消毒的剃须刀不知道会不会效果好些，切的快而且块更小些。
12 加入培养液（含双抗、ECGs、肝素）1.8ml，倒置培养瓶在37℃、5%CO2培养箱放置90min到120min，轻轻翻转培养瓶继续培养。放置到72小时，加入1.5ml培养液继续培养观察。期间不动培养瓶。
使用上述方法，我试验了15只老鼠，只有一次同时养成成纤维、平滑肌、还看到了内皮细胞，但是那次贴壁时间长达4小时，内皮很少，最后完全没办法进行纯化。其余很多次到了第8-9天才有成纤维或者平滑肌苗条细长的身影出现，最后都是成纤维了。都被我拿来练习传代、冻存、提取RNA了。浪费了不少培养液。现在操作从杀死老鼠到贴完块大概40分钟完成，但是战友说要30分钟内完成，我想最关键就在这里了；干贴壁的时间我试过60分钟，90分钟，120分钟，4小时，最长6小时，培养液我加过1ml、1.5ml、1.8ml、2ml、2.2ml、2.5ml、3ml；觉得如果片展平的话，1.5ml可以基本浸润住组织块但不淹没，内膜和中层可以沾到或者泡在培养液中；1ml基本上铺不满培养瓶底，好多组织块仅仅稍微沾到培养液，2.2ml、2.5ml、3ml则都多了，容易使组织块漂起来，也只是漂个3-4块，整个组织块都浸泡在培养液中，平滑肌和成纤维可以获得很好的营养，长的也快。
关于观察的时间，我体会贴完翻瓶后，最好72小时后再观察，最早48小时，不然每天观察的话，反复的来回拿，液体冲刷瓶底，最后漂起来的组织块越来越多，最终是养不成的。
