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标题:[求助]Caco-2细胞测跨膜电阻为什么长不上去？

greenbee[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]Caco-2细胞测跨膜电阻为什么长不上去？



我的Caco-2细胞养了２１天了，没有清洗时电阻都只有２００多欧／cm2,用ＨＢＳＳ清洗后就只有１００多．在显微镜下还可以看到小空隙了！
请问在种细胞之前是不是要在膜上涂鼠尾胶原喃（我没有涂）．有人知道电阻上不去的原因嘛？急切求助．
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小鱼鱼[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的Caco-2 在什么里面养了21天？
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jujuba[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在养，我的电阻测定值大概也就是120-130欧，减去空白值乘以面积，都只是>200点点,根本不可能有文献说的500多,不过文献标准说了200-500就算完整了。
我用的是transwell，应该不用涂胶的吧，你用的是什么？
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flower-201[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，你的细胞是多少代的？40-50代后的细胞不好长，或者说不容易有好状态；
其次，你用的什么培养条件，标准是MEM of 10%FBS，可用DMEM，如无FBS，用20%NBS也不错，要加NEAA；
再次，你的HBSS预热了吗，其实我觉得不如用带血清培养基来洗，比较合适，也可以再HBSS里添加BSA，0.1%-1%都没问题，用于保证胶体渗透压，和CFSE一个道理。
最后，勤换液，transwell里7天后，天天换液，其实剪掉空白近三百就可以做实验了，但是镜下一定要无空隙。
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的Caco-2 在什么里面养了21天？

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是接种在transwell上养的
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u234[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
由于地震,CO2罐被摔坏了 ，细胞也因为几天没有CO2而死亡了！现在准备从头再来……
我用的transwell，我是看到有的学位论文报道涂了胶原的，准备下一步涂了 胶原再接种。另外，清洗细胞的时候没有预热HBSS，这可能也许是导致细胞被清洗下来一部分，出现小空隙的 原因吧，细胞不知道是多少代了，因为是别人赠送的。
其它还有什么需要注意没有啊？多多提意见哦
我的,希望能和大家多多交流经验……
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我还想问一个问题，因为镜下是看不见细胞的吧，就看到麻麻的点点，摇动板子是可以看到漂浮细胞的影子，那么有没有小空隙要怎么看啊？？

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还想问问，你做荧光黄Papp么？？它的值能达到要求的<1.0*10-6不？？我很是着急啊~~
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发表于 2012-2-18 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我打算测HT29细胞的通透性，想请教一下，除了测TER，还有什么方法？如果测TER需要什么设备、试剂?具体操作步骤如何？先谢过了。
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 关于电阻的问题，如果细胞长的好的话，应当是在500欧姆每平方厘米，这里面有一个换算的问题，用电阻计读出的数值并不是最后的数值，应当乘以transwell膜的面积，一般是4.46到4.71 cm2，所以如果测得的数值是100多（当然是扣除背景以后）就可以达到500多了，所以这一点你应当检查一下。如果乘完之后还是很小的话，那就说明膜有问题。
2. 提到有小点，很大的可能是在换液过程当中把膜扎破了，因为Caco-2在transwell上生长的时候是单层膜，很容易受到外力而破掉，所以一定要多加小心。
3. 有些细胞悬浮在上面，那些是代谢死掉的细胞，或者是细胞的代谢产物，活细胞应当是贴壁生长的。
4. 如果还不是很确定的话，可以做做marker，一般做两个，测transcellular的话就用普萘洛尔，证明细胞生长正常；测paracellular的话用阿替洛尔，证明细胞间隙连接紧密。Papp范围一般文献上都会有的。
祝你好运。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我还想问一个问题，因为镜下是看不见细胞的吧，就看到麻麻的点点，摇动板子是可以看到漂浮细胞的影子，那么有没有小空隙要怎么看啊？？

还想问问，你做荧光黄Papp么？？它的值能达到要求的<1.0*10-6不？？我很是着急啊~~

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我用的膜面积是0.33CM2的,在镜下可以看到细胞,可能是你用的膜不一样就看不到细胞哈,我做过荧光素钠,但是结果不太理想^^^
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