[求助]关于Hoechst/PI双染的疑惑

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标题:[求助]关于Hoechst/PI双染的疑惑

dog002[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠好：最近我在做诱导细胞（贴壁）后的Hoechst/PI双染的检测，有很多疑问，在此想请教大家：
1.诱导凋亡后用hoechst染色，发现出现如图片出现的现象，没有很典型的apoptosis body，亦没有核的边集，我想请教大家的第一个问题是：从图像上来看，到底我的细胞有没发生apoptosis？

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2012-2-18 14:42

53979447.jpg (82.67 KB)

owanaka[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得这样不大看的出来凋亡与否，Hoechst/PI双染一般用流式的方法来检测凋亡是否发生。

Hoechst 33342染色通常与细胞膜通透性变化相关。凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而PI等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。通过这种方法对凋亡进行检测。

dog002[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第二个问题：我同时也做了PI染色，目的是想区分apoptosis和necrosis，但是问题又出来了：PI染色发现坏死很多，通过不同的荧光激发，发现hoechst深染皱缩的核（应该是凋亡吧）在绿光激发下，看到也是发红光！即同一个细胞核在hoechst染时是深染的，但亦被PI染成红色，这说明我的细胞既发生了坏死也发生了凋亡么？即是说发生的晚期凋亡然后再坏死的，可以这样理解么？下面是同一个视野下不同荧光激发的图片，衷心感谢大家的指导！~

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2012-2-18 14:48

41531759.snap.jpg (27.01 KB)

dog002[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是同一个视野下的PI图片

附件

2012-2-18 14:48

52714876.snap.jpg (17.49 KB)

dog002[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2012-2-18 14:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为什么不用AnnexinV染？很明显的啊

owanaka[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

凋亡检测有很多种方法，常用的有Annexin V-FITC双染，DNA ladder，TUNEL，PI单染等等。TUNEL的图片很PP。
还有，你说的没错，如果用Hoechst/PI双染，细胞是不能固定的，否则所有细胞都会结合PI。因为这种方法就是基于细胞膜对不同DNA染料的通透性差别，如果进行细胞固定，所有的差别就都消失了，这种方法也就失去了意义。

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发表于 2012-2-18 14:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

能不能传授一下染色的具体步骤，直接配好染色剂依次染色检测就好了吗？

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发表于 2012-2-18 14:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我之前做了1个多月的关于细胞凋亡和坏死的鉴别方面的工作，有下面这些体会，大家交流一下：
1、判断的最终标准是细胞形态学改变，尤其是电镜下的。当然，特异性的DNA ladder和TUNEl也可以说明问题。TUNEL阴性不代表没有凋亡，加做DNA ladder。
2、PI+Hoechst染色结果除非跑流式，否则这样荧光显微镜下数细胞缺乏判断的依据，到最后连自己都会犯糊涂。
第2点我感受很深。我从荧光下细胞的大小和荧光强度谈谈。
首先，细胞大小养的细胞种类有关。我不知道lz养的是什么细胞，但我感觉正常的细胞应该是像图1中8点位置那个肾形细胞，hoechst淡染均匀。其他有些圆形的细胞怎么回事我就搞不懂了。对于那些缩小亮染的细胞，首先要搞清楚它们是不是粘附在正常细胞上面的坏死细胞，没有看到lz光镜下的图片不好判断。如果是的话，那么在处理后出现的这种情况就不能说明问题了。我一般的拍照习惯是先照PI（红色，判断有无坏死），然后hoechst（蓝色），最后一张光镜。这样就能判断那些荧光下核缩小细胞究竟是不是凋亡细胞。lz第一张图我估计中间那团细胞里面肯定有坏死细胞黏在上面，做个PI也会是不少红色的。第2、3张图打圈的细胞照理论上来说应该是坏死。周围的看起来像正常细胞。其实坏死细胞和晚期凋亡细胞都会出现这种情况，我觉得就不好区分了。
其次，荧光的强度可以通过改变曝光的时间获得自己想要的结果。
总之，要想通过观察判断荧光下凋亡细胞确实有难度。理论上说的是一套套，自己做起来又不是那么回事。如果有条件，最好最好是流式算了。
在非单一造模条件下（比如缺氧复氧），其实细胞凋亡应该不是群体细胞的死亡行为，如果确实观察到大部分细胞出现hoechst+++/PI--疑似凋亡的细胞，我觉得应该慎重判断。

自己做的是心肌方面的，不知道对不对，各位大侠指正。

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2012-2-18 14:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这种染色方法不进行多次试验、摸索是很难出阳性结果的

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