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标题:[求助]3T3-L1诱导分化遇到困难!

loli[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]3T3-L1诱导分化遇到困难!



养了有半年的3T3-L1,最近做诱导分化实验,可总是失败,到分化后第4天,细胞不少死亡,而且周围有大量黑点,还有脱壁情况发生.
这使我对细胞本身产生了怀疑,因为这细胞是别人送给我的,也没有什么方法对其进行鉴定,因此不知道它到底是不是3T3-L1?
另外其它几个失败原因分析一下可能有:
1, 细胞隔天换液, PH迅速降低, 培养基颜色近似白色,低PH值导致细胞死亡.或者营养物质耗尽,导致细胞死亡.
2,不知用乙醇溶解Dex和IBMX是否恰当，担心乙醇会对细胞产生毒性作用！
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yes4[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在养3T3-L1细胞,还没做到诱导分化,希望和你共同学习,不知你是哪里的,我在武汉.
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在大连，我养的3T3是别人送的细胞，最近诱导老是失败，因此对我的细胞真实性产生怀疑，但又不知3T3-L1的鉴定方法，所以挺郁闷的
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞confluent2天后加IBMX+Dex+insulin，2天后发现细胞形态明显变圆，然后

加只含胰岛素的培养基，可是一天后发现细胞有去分化现象，即从形态上看

细胞由圆形变回梭形，郁闷，不知是不是胰岛素问题，我准备再用IBMX+Dex

+insulin诱导2天，看行不行！
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S6044[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

晕，那很正常啊，接触抑制两天后加诱导剂，细胞就是收缩变圆的，然后D3天只加insulin，细胞就重新变回梭形，诱导后要注意加液要特别轻缓，因为分化时细胞贴壁不牢，加液一下子加进去细胞会被冲起来。
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发表于 2012-2-18 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在养3T3-L1,希望和大家交流.新手.现在正在左诱导分化试验,诱导两天后,细胞开始变园,第三天只加胰岛素,好像没有看到细胞变化,不知道大家诱导剂配方和浓度如何?我也适用的乙醇配的地米和IBMX,担心分化不了?
另外我想知道第四天后换用dmem培养基后,也是隔一天一换液吗?
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：你诱导细胞分化大约需要多少天？
“然后D3天只加insulin，细胞就重新变回梭形”，我较难理解！那到第几天细胞又重新变回圆形呢？
我还以为是脂肪细胞去分化呢？能否给我解释一下其中的缘由？多谢l！
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131415[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

接触抑制两天，MDI两天，insulin两天，只medium两天，再只medium两天，从诱导剂开始一共八天，一般到了第六天脂肪滴就全出来了，剩下两天就是积聚的过程。也有过分化效果很好的，第四天脂肪滴就全出来了。
就是MDI两天细胞变圆，insulin两天的时候细胞就是恢复梭形，至于为什么，大概就像为什么一定要接触抑制两天一样的理由，我也不知道^_^，一直做分化都是这样的。
而且对于“变圆就是分化，变梭形就是去分化”这个观点不晓得是从哪里看到，能否告诉一下？我做细胞分化有两年了，似乎还没有听说过这种判定标准，也么有看到相关文献，师兄师姐们还有俺们的大boss都没有告诉过细胞形态与分化的关系，所以这点想请教呢。先谢了^_^
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢你提供的一些宝贵意见，我只是从一篇综述（张崇本，2004，脂肪细胞的分化及调控）上看到 “有人认为细胞形态的变化是分化过程中必须经历的一步，而不仅仅是脂类积累的结果。” “细胞形态的变化是脂肪细胞分化的早期标记之一”。也许我的判断太过武断！
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-2-18 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再上传几张图片，由于没装摄像头，在倒置显微镜下用数码相机照得，效果不好，这是细胞诱导分化d3的照片。希望各位高手能否给点指导！
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2012-2-18 16:32
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