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标题:[求助]transwell 做体外侵袭实验膜上没有细胞

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]transwell 做体外侵袭实验膜上没有细胞




我在用transwell做肿瘤细胞体外侵袭实验,做完后细胞没有穿过胶,膜上没有细胞.
我的实验步骤是
1.将胶和无血气培养基1:4稀释备用
2.将胶4度液化后加75ul铺到小室的膜上.
3.将铺好的小室放到37度培养箱中8小时.
4.消化好细胞,将密度调整到10^5/100ul,加到小室上室.下室加
条件培养液.孵育18 -20 小时.
5.固定,染色.
显微镜下观察发现膜上没有细胞,有哪位大虾做过这个实验的,请帮忙指教啊!
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windy+++[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
产生这个结果有多种的可能性：
1、可能你的Matrigel的浓度用的有点大了，可以参考文献中别人做你这个细胞时一般用的多少浓度，有的细胞侵袭能力不是很强，浓度大了就过不去，如果没有人做过就只好自己做梯度了；
2、培养时间不够，我将从10h－48h的都有，不同的细胞时间会有所不同；
3、其实是过去了，你没有看到？这个实验做完后是要染色的，不知你有没有做这一步？一般用结晶紫染效果会好一些，染色后把没有穿过的细胞擦掉，再观察穿过膜的细胞。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的朋友讲的很好，我再补充一下：
4。有些细胞本身是没有侵袭力或者侵袭力非常若，即使是肿瘤细胞。建议用酶谱法检测一下MMP-2的活性，或者加用PGE2等明确可以增强侵袭力的药物处理一下。排除细胞本身的原因。这一点很重要，而往往被大家忽视。
5。多重复几次。我有时候用同样的条件，就是没细胞穿过去，真是活见鬼。
6。条件培养液的成分。是否有足够的趋化因子？可以增加浓度或者换用其他趋化因子。建议用浓度高点的血清试试。
7。染色。我用的是结晶紫染色。染色前要将膜风干，不然难以染上颜色。染一次没颜色，可以在风干后再染一次，并延长时间。
8。可以先在镜下看看，如果膜上有细胞的话，镜下是可以看到的，以排除染色的问题。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我已经将胶的浓度调整了一下。我现在在用1：6的胶40ul试试，结果还没有出来。我准备孵育24小时，甚至更长一点。到时候把结果向大家汇报啊，谢谢大家。
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麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的也是这个结果啊，我的Matrigel已经1：10稀释了啊，但是我板底是用Gelatin或者胶原，是不是用FN更好点啊。
顺便问一下，如果用FN的话，包板的浓度是多少啊。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
the pore size on the transwell is important. Some tumor cells are very big. SO you should choose the approperate pore size. And the attration has to be strong enough. Cell density should not too high.
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麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的HMEC-1内皮细胞株，我看了一下，应该不是很大（当然我不能确定），不知道为什么？
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麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外我还想问一下，一般我们用的transwell孔径是8um的，那有没有12um孔径的transwell板呢，如果有请告知货号，谢谢。
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发表于 2012-2-18 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有谁做过粘附抑制实验呢?
MTT法检测还是直接计数粘附细胞比较好呢?另外,也对包被板的Matrigel浓度及时间不大清楚哪,包被后到底是在二氧化碳箱里还是4度冰箱?
请各位大侠多指教!
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的大侠
我用1：6的胶40ul试了24小时。显微镜下可以看到细胞已经穿过了胶附着在没的小室内表面，但没有穿透到下表面。
我用的是胆管癌细胞，侵袭能力应该还可以。24小时后我发现在小室没面的膜上的细胞都聚成堆，5－10 各一群，细胞和细胞之间有连接。我怀疑是由于细胞聚集后穿膜的能力下降了。有可能是我的细胞的量加的有点多。我之前加的是2×10^5。我准备再用低密度的细胞做一次。
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