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标题:[求助]293细胞培养传代的问题

ero11[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]293细胞培养传代的问题



上周复苏293细胞一只，在复苏时细胞贴壁和生长都良好，传代一次细胞生长也没问题，可是在第二次传代后细胞就几乎都不贴壁了，显微镜下观察并没有污染的迹象。

传代时用的是0.025％的胰酶加EDTA消化不到一分钟就弃去消化液，用培养液中止后吹打并分瓶。传代中没敢离心（直接弃去了消化液），传代后也没敢动细胞，忍耐了24小时后才观察的。第一次和第二次传代方法相同。

培养液放得太多或是在没完全贴壁时被摇晃会影响293贴壁吗？

请各位大侠指点一二。谢谢！
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ero11[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用的是ORANGE的一次性75CM培养瓶，未做其它处理。
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胰酶浓度应该是0.125%，：）
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kswl870[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
（一）293细胞的制备
1 10´枸橼酸盐消化液的配制：取50g氯化钾和22g枸橼酸钠溶于双蒸水中至500ml。121℃高压灭菌15分钟。使用前用灭菌水10倍稀释。
2 用含20%小牛血清的IMDM培养液常规方法复苏293细胞，待细胞长至80-90%融合时，吸去培养液，用1´枸橼酸盐消化液洗2次。
3 加入能够覆盖单层293细胞的消化液（约1-2ml）。
4 室温孵育15分钟，可见贴附于瓶壁的细胞开始松散。
5 轻拍瓶壁使细胞完全脱落，不能吹打细胞。
6 将细胞悬液吸入离心管中，1000rpm/分，5分钟。弃去上清，按一定比例稀释细胞沉淀（一般不宜超过1：3瓶）。
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问只用枸橼酸盐消化液消化比用胰酶好是吗？

消化过程中是否需要尽量避免对细胞的吹打？
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toy[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用EDTA消化细胞须洗干净，否则细胞不宜贴碧。
其实293很好消化，0.1%胰酶即可，用不着加用EDTA。
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发表于 2012-2-18 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也觉得 没有必要加 EDTA ，加了好象 消化太快了，来不及处理。
即使用了，后面一定要好好冲洗，要不不贴壁。
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发表于 2012-2-18 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好象没那么严重.
我养的时候,做的很粗糙,就是用0.1%的胰酶直接消化,加入胰酶大概来回轻摇6次,就OK了,然后马上倒掉那些胰酶,可以用手拍一拍,有利于细胞的脱落,但是必须拍几下,就看看,大概有30%掉下来的时候,就加入DMEM培养液,然后用移液管轻轻吹打贴壁的那一面,大概10次左右即可.
传代的时候不需要离心.
加胰酶的时候,要把培养瓶倒过来.我的意思是,加胰酶的时候,要对着细胞没有长的那一个壁,不要让胰酶直接碰到细胞贴壁生长的那个面.放下等待细胞脱落的时候,也要倒着放培养瓶.否则无法控制消化速度.
不好意思,我也是跟着老师养的,所以也不太懂,希望这些能有用吧
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lagua123[使用道具]
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发表于 2012-2-18 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我近来细胞状态很差，难道是因为在胰酶中加EDTA的原因吗？加入EDTA后感觉消化很快。楼上各位说的要将EDTA完全去除，不知应怎样做？我消化细胞时也是不离心的，只是在细胞间隙变大时将消化液吸出，这样总会有残留。
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 小中大
谢谢各位，我准备改单用胰酶消化，同时也准备去拿一株新的293回来养养，如果有改善我就回来报道，欢迎养293的同学们一起交流，：）
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