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标题:[分享贴]hep3B细胞的培养心得

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发表于 2012-2-22 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[分享贴]hep3B细胞的培养心得



本人养了大半年的hep3B细胞，目前细胞状态良好，考虑到之前在丁香园也受到各位大侠的帮助，小女特将一些经验在这里与大家分享
1.培养基：MEM血清（最好是含谷氨酰胺的MEM），本人购买的是gibico的MEM粉剂，然后按说明配置成的。
2.血清：这个细胞比较娇气，最好用国产胎牛之上等级的血清，我最差就是用国产四季青的胎牛血清了，状态不好抢救时都动用了HYCLONE的胎牛血清。
3.培养瓶：最好用一次性的塑料培养瓶，在玻璃瓶里面贴壁不牢固，但是还是可以贴壁的。
4.换液：用PBS或者DHans都可以，但是不要吹打细胞，来回晃动瓶子就可以了。我一般都是来回晃动20次左右，直接将PBS吸出。
5.消化：ATCC以及卖细胞的老师都跟我说用加0.02%EDTA的胰酶消化，但是很难消化，无意间我用不加EDTA的胰酶消化，反而更快更容易消化。hep3B细胞喜欢抱团生长，所以基本上是5，6个细胞抱团成菊花样，我的消化经验是等细胞团之间出现裂隙，地图样块状的时候就可以终止消化，然后反复吹打，尽量成单细胞悬液再传代。（不然细胞抱团贴壁后，容易成团生长，铺展不开，最里面的细胞容易死亡）
我的方法是：等出现地图样块状时，吸去胰酶，再加入血清吹打。不要等到细胞飘起，不然细胞状态就容易变得不好。
另外，这个细胞最好是1：2传代，细胞密度太少，细胞生长状态也不好。
6.冻存：本人用的是1：3：6（DMSO:胎牛血清：MEM）的冻存液冻存，目前每瓶都复苏成功了。
7.复苏：与其他的细胞没有特别的地方。
8：细胞形态：跟hepG2有点像，但是比它丑多了，胞浆里面很多粗大的黑颗粒，喜欢抱团生长。本人这里没有照片，于是就引用原来丁香园里面的一个照片给大家看看吧。
个人感觉如果培养基跟血清用好以后，这个细胞还是比较好养的，主要是消化这步需要特别注意下，消化时间过长对细胞有很大的伤害，而这个细胞又不是很好消化，所以需要特别的注意。希望对大家有帮助。


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2012-2-22 10:59
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发表于 2012-2-22 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胞内外的黑色颗粒，怀疑污染
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发表于 2012-2-22 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个照片是引用的，没有看那么仔细，很佩服楼上的火眼金睛啊。不过还是可以看到细胞的形态，跟胞浆粗大的颗粒。
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发表于 2012-2-22 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的Hep3B、Huh－7和PLC都养得不错，用的是GBICO的瓶装DMEM + HEPES和GBICO的澳洲胎牛血清，冻细胞用10％DMSO＋90％FBS，平时操作也没什么特殊要求。
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发表于 2012-2-22 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好 我最近也在养Hep3B，为了这个细胞简直是心力憔悴了。之前养过一次，开始还好，我可是用Gbico的进口胎牛血清养的（贵啊），后来一夜之间就出现浑浊，不过没有变黄，而且里面看到有做变形运动的小黑点，细胞都碎掉了，最后全部丢掉，复苏以前冻存的细胞也是如此，传几代就浑浊，最后全部放弃。最近又从上海细胞库买来新细胞，血清也是从那里带来的德国进口的，因为他们就是用的这种血清，开始也还好，在我冻存了6管以后，今早发现四瓶有三瓶浑浊，出现类似的情况。查了资料，初步怀疑是支原体污染，或者是黑胶虫。这个黑胶虫也没有人真正发现过，所以也无法定论。还希望您能指教一下，另外我在长沙，如果能蒙您惠赠一瓶，则不胜感激！
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发表于 2012-2-22 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一夜之间就出现浑浊，不过没有变黄，而且里面看到有做变形运动的小黑点，细胞都碎掉了
应该是污染了吧，问下之前上海那边有没有加双抗，再就是操作要注意无菌跟器具的消毒（具体的步骤可以在版块里面找的到），另外培养箱的环境也是很重要的。
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发表于 2012-2-22 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
8：细胞形态：跟hepG2有点像，但是比它丑多了，胞浆里面很多粗大的黑颗粒，喜欢抱团生长。本人这里没有照片，于是就引用原来丁香园里面的一个照片给大家看看吧。

胞浆里面很多粗大的黑颗粒，我养出来的也是，培养基空培没有黑胶虫等细菌污染，请教养过的战友说说Hep3B里的空泡和黑颗粒倒底是什么？是细胞本身的吗？
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发表于 2012-2-22 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我马上要开始养kepG2了，第一次养细胞，看到大家遭遇的困难，心理很有些没底啊。。。。虽然他们都说这是最好养的细胞之一。。。。
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 小中大
我用的是HYCLONE的胎牛血清，因为还养其它的细胞我就干脆换成了DMEM培养基，养的也不错。
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mamamiya[使用道具]
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 小中大

我的G2细胞就老是有一些漂浮的死细胞，但是贴壁的很好，跟菊花瓣一样，很漂亮。
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