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标题:[求助]流式检测不同荧光抗体加入先后有关系吗

tuuu2[使用道具]
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发表于 2012-2-22 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]流式检测不同荧光抗体加入先后有关系吗




我正在做流式细胞仪检测外周血内皮祖细胞数目，用直接荧光标记，抗体选择了FITC-CD34、PE-KDR、APC-CD133，流式检测效果不好，请教各位高手，请问加入抗体孵育时，先后顺序有无关系，有什么说法吗？
谢谢了
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发表于 2012-2-22 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般的流式操作指导都没有特别指出抗体加入的先后顺序，但我个人的体会是，如果做复杂标记，如三标，如果效果不好可以考虑调整加抗体顺序，从细胞表面分子的表达丰度考虑先加表达丰度低的表面分子的抗体，后加高丰度的；从荧光淬灭情况考虑，先加荧光稳定的，后加不稳定的。
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发表于 2012-2-22 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
和加的顺序没什么关系，你这个课题的问题是细胞数量太少，有时根本不知道是真的标记上了还是非特异性标记。此外，你应该还要用CD45做个标记，联合CD45和SSC设门，排除造血细胞。用流式检测这个的文章，不要说国内的那些杂志，就是SCI的文章我看着都觉得悬，同情中。
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发表于 2012-2-22 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我明天试试改变一下顺序看看
顺便再请教一下 不知有没有碰到过做流式抗体标不上的情况啊 还有哪位前辈碰到过这种情况 我用一份标本 分别加入PE和FITC标记的CD34抗体，PE的可以标上，而FITC的却标不上（抗体是新买的，没过保质期）请前辈帮忙分析一下
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发表于 2012-2-22 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上说的是 我参考了一篇国外的文献 他的流式图中细胞数目和分群都很明显 而我的结果却是寥寥无几 但问题是好多的文献都给出了流式的图片 而且检测到的细胞数目还大致在一定的范围内 郁闷中
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发表于 2012-2-22 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BD的CD34应该以FITC为准，PE信号比较强，但是有非特异性。
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发表于 2012-2-22 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵 前面已经听前辈讲过了 不过我以前做的CD34-PE都是加PE的对照抗体的
这次PE做出的是0.15% 而FITC做出的只有0.03% 请教alixtardxy前辈，不知相差是否会这么大啊？
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发表于 2012-2-22 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
外周血中的内皮祖细胞是很少的 但测定的方法上来说 流式还算是比较好的一种了
只有从每个步骤上都更加注意点 尽量减少非特异性的影响了
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发表于 2012-2-22 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也准备做这方面的，多交流啊。我这几天就准备问问做流式的老师有没有什么需要特别注意的呐，文献是文献，但是其实做起实验来，文献上那点内容不管什么用的。不过好像裂解红细胞，除掉红细胞的影响是满重要的，大家多交流啊。
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owanaka[使用道具]
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发表于 2012-2-22 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵 前面已经听alixtardxy前辈讲过了 不过我以前做的CD34-PE都是加PE的对照抗体的
这次PE做出的是0.15% 而FITC做出的只有0.03% 请教alixtardxy前辈，不知相差是否会这么大啊？

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说实话，这个我没经验。我原来的老板在国外做单细胞分选时就发现的这个问题，因此我们在分析数量稀少的CD34时就没用过过PE，只是在白血病免疫分型时用过这个抗体。

之前有些研究生在我们实验室做这个东西，所以我帮忙上过样，非常头疼。在造血干细胞中，CD34阳性的细胞群体虽然也少，但是细胞聚集性比较好，很明显就知道是CD34阳性的，而这个内皮祖细胞这分散的很开，搞不清是不是非特异性标记，所以对照是非常重要。

上面有人说了红细胞裂解很重要，确实很重要，不然会发现阳性比例低的难以忍受。
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