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标题:[求助]做细胞融合,为何融合率不高?

wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-2-24 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]做细胞融合,为何融合率不高?




为什么我在做细胞融合时,滴加完PEG,无血甭培养基终止后,会出现小的片状,碎渣子状的东西,是不是杂交瘤细胞与脾细胞破了?而且融合率都不高,大约20-30%,为什么?
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-2-24 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

融合率20－30％是什么意思？是说20－30％的孔有杂交瘤长出来吗？如果是的话那可能就太低了。
我们一次融合一般可得到约2800－3200个杂交瘤细胞/小鼠脾,使用的是四季青的胎牛血清(如果用Gibco的结果更多一些).
楼主应该把你的材料和方法详细说出来,大伙才能有的放矢地帮你解决问题呀.
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-2-24 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

方法是：脾细胞与杂交瘤细胞按2:1-10:1，一般是按4:1的比例，1000转/分，10分钟。然后取PEG1ml 90秒内加入离心管中，边加边轻轻转动，然后在90秒内加完3ml无血清培养基，最后再补加无血清培养至20-30ml。(均在37度水浴中进行)。就在加完3ml培养基后，可以看到液体中成碎渣状，片状的东西，只要出现这种东西融合率肯定不高，甚至没有克隆。
但是以前没出现过这种情况，有时融合率也不高。
我用的血清有四季清的新生牛血清，也用过Hycione的类胎牛血清，也用过Gibco的新生牛血清，均是15%的浓度。

多谢大家的帮助！
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-2-24 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的血清可能不行!
你很可能没有做过血清的质量检测(支持极低密度细胞生长的能力).
我也用过Gibco的新生牛血清,结果是长出来的融合细胞很少,四季青的新生牛血清我没用过(不会比Gibco的新生牛血清好吧?),hyclone的产品我是坚决不用的(以前同事用的试用装很不满意).
现在我用的是四季青的胎牛血清,得到的杂交瘤的数量如上贴(其实有时会更多)
另外,加完PEG后用基础培养基稀释时,基础培养基要一滴一滴地加(3秒一滴),这一点很重要,否则细胞会涨破!不知楼主注意了没有?

还有的是,细胞融合后的生长环境对形成的杂交瘤数量也有巨大的影响.我的杂交瘤在液体培养基中长的很快很好(经常有些杂交瘤在5/6天时就可做检测了),但同时做的融合接种在甲基纤维素半固体培养基中的杂交瘤就是长不好,数量也少的多,仅有液体培养基中的四分1左右(接种体积密度相同的条件下)
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-2-24 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢你的回复！

你用的四季清胎牛血清都是一个批号的吗？血清质量检测怎么做？我是一直头疼用哪个血清的问题，但不知怎么检测，听说挺复杂的。

我在加基础培养时也是一滴一滴地加的，倒不一定是3秒一滴，反正在3分钟内加完。我也怀疑是不是在加PEG时我的手法有问题，我断断续续做了好多次融合，融合率达90%以上的也有几次，融合率20-30%也有，都不稳定，而且有的克隆细胞团长得也不好，不像有的长得亮亮的，看起来很舒服、漂亮。我也不知道是什么原因。
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发表于 2012-2-24 14:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，血清最好用自己杀牛制备的血清，PEG用液体进口的。融合率可以达到95%以上呀。
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-2-24 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

依照我们这里的经验我觉得可以做一下改进：

1。可以适当提高PEG的浓度，这样可以增加融合率。

2。我们这里中和用的都是进口的胎牛血清，杭州四季青的也用过，感觉进

的好一点，关于无血清中止液的问题，我们这里细胞消化用过，感觉不能完

全中止，所以融合是没有用，个人觉得还是改用胎牛血清中止比较好。
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发表于 2012-2-24 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的建议!
PEG的浓度不是50%的吗?若要提高,应该提高多少才好呢?
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发表于 2012-2-24 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

50％好像已经算高的了，我们这里一般用两个浓度50％和37％。
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发表于 2012-2-24 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于融合率不高的问题，我觉得最重要的一步是在加入PEG和无血清培养基的这段时间内，其他的只要严格按照普通常规方法应该是问题不打。对于加入PEG后，你可以试着轻轻的用你手中的毛细吸管把细胞团弄散，这个步骤是你加第一滴PEG就开始。在60-90秒中加完PEG后要等带待1分钟左右再终止PEG，起码让他起点作用吗。
对于这个相似问题以前的帖子曾经讨论过，cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=758991&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#758991')
你可以看下，有没有启发。
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