[求助]软琼脂克隆试验细胞为何贴壁生长？

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标题:[求助]软琼脂克隆试验细胞为何贴壁生长？

kulee[使用道具]
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发表于 2012-3-6 12:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.使用低熔点琼脂糖，凝胶点为30度。
2.铺下层胶(0.5%)后置4度保存。
3.临用前室温复温1h。
4.铺上层胶(0.3%)后置入培养箱培养。

室温复温可以排除下层胶冷缩，导致与孔壁贴合处出现缝隙。
所有液体操作时温度均低于40度，可以排除上层胶加入后导致下层胶熔解。

请问为何上层胶中细胞还是会漏到培养板底部呢？

831226[使用道具]
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发表于 2012-3-6 12:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以看到贴在那儿的,但是你换个焦距,就能看见圆圆的细胞了.

kulee[使用道具]
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发表于 2012-3-6 12:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #2 831226 的帖子

但是如果大量细胞贴壁的话，接种的细胞数目就不准确了。
PS：今天抱着试试的心态，将上层胶吸了出来，结果发现很多孔中的下层胶也被带了上来。理论上下层胶不是凝固的么？

911[使用道具]
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发表于 2012-3-6 12:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #3 kulee 的帖子

你的细胞是在37度培养的吧。
同时你的帖子中提到，凝胶点在30度。这说明什么呢？
是不是在37度的培养环境下，胶体有溶解现象？

kulee[使用道具]
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发表于 2012-3-6 12:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #4 911 的帖子

该琼脂糖的特性如下：
Gelling Range (1.0%) (°C)
24 - 29

Melting Range (°C)
62 - 68
凝胶点是出现凝胶的临界反应程度。多官能团单体聚合到某一程度，开始交联，粘度突增，气泡也难上升，出现了所谓的凝胶，这时的反应程度称作凝胶点。

熔点是62至68度数之间，所以在37度培养箱中并不会熔解。

PS：今天再次观察了最早做的一个培养板，却并未出现细胞贴壁的情况。

每次操作条件几乎都是相同的，怎么有的却不出现漏细胞的情况呢？

无法重复啦，请高手指教～～～

911[使用道具]
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发表于 2012-3-6 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是没有混匀?
可能是什么呢？

这个实验我正准备做呢。昨天由于2X培养基没有准备好，所以改在今天实验。

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发表于 2012-3-6 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 911 于 2012-3-6 12:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可能是没有混匀?
可能是什么呢？

这个实验我正准备做呢。昨天由于2X培养基没有准备好，所以改在今天实验。

接种细胞前都吹打均匀了阿～
继续等高人来解答～～～～

911[使用道具]
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发表于 2012-3-6 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教楼主的上层下层的琼脂糖铺制方法
1）下层0.5%，铺制时的温度？
2）上层0.3%，铺制时的温度？
分别是55度和37度吗？

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发表于 2012-3-6 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 911 于 2012-3-6 12:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教楼主的上层下层的琼脂糖铺制方法
1）下层0.5%，铺制时的温度？
2）上层0.3%，铺制时的温度？
分别是55度和37度吗？

37～40度之间。

kulee[使用道具]
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发表于 2012-3-6 12:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 kulee 于 2012-3-6 12:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

37～40度之间。

我自己的理解是
下层可以37--55度
上层在37度左右。

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